基于功能型寡聚核苷酸传感界面的电化学生物传感器

发布时间：2020-06-13 23:14

【摘要】：功能型DNA是指一类通过体外筛选或指数富集的配体进化系统(SELEX)筛选出来的具有酶功能或是识别功能的短链DNA。功能型寡聚核苷酸是功能型DNA的其中一类。电化学生物传感器因其具有便携性、操作简单、灵敏度高、耗材量小等优点,因此在环境监测、生物分析、法医鉴定、食品安全等领域日益受到重视。本文将功能型寡聚核苷酸和电化学传感技术相结合,构建了三种新型的阻抗型免标记电化学传感器,用于对三聚氰胺和重金属汞离子的检测,研究内容如下:(1)基于胸腺嘧啶(T)和三聚氰胺(Mel)通过氢键作用形成T-Mel-T结构,构建了一种快速、灵敏的电化学生物传感器,用于牛奶样品中三聚氰胺的检测。首先,以S-Au键将巯基修饰富T碱基寡聚核苷酸(TRO)固定在金电极表面,然后以巯基己醇(MCH)封闭电极表面的空位点,得到TRO修饰传感界面。当TRO上的胸腺嘧啶(T)和三聚氰胺(Mel)作用形成T-Mel-T结构后,引起TRO的构象改变,进而会改变电极的电化学行为。以[Fe(CN)_6]~(3-/4-)为电化学探针,采用电化学阻抗谱(EIS)考察了传感器对三聚氰胺的分析性能,结果表明,在最佳条件下,阻抗差值(ΔR_(ct))与三聚氰胺浓度对数(lgC_(Mel))在10.0 pM~1.0μM浓度范围内有良好的线性关系,检测限为1.2 pM。将传感器应用于牛奶样品中Mel检测,回收率为96.4~104.4%。(2)基于富胸腺嘧啶(T)寡聚核苷酸和汞离子(Hg~(2+))能形成T-Hg~(2+)-T结构,构建了一种新型多“三明治”核苷酸链的汞离子电化学传感器。首先,在金电极表面以S-Au键固定探针DNA(IS),并用巯基己醇封闭电极上的空余位点;然后通过修饰电极反复交替和汞特异寡聚核苷酸(MSO)、连接两条MSO的桥接链DNA(BS)杂交,形成MSO-BS交替相连的多“三明治”核苷酸杂交链,并因多核苷酸序列而产生大的阻抗。当修饰电极与Hg~(2+)作用后,传感器界面的MSO和Hg~(2+)形成U形T-Hg~(2+)-T结构,导致多“三明治”结构迅速瓦解,引起阻抗降低,从而达到对Hg~(2+)的高灵敏检测。采用电化学阻抗谱(EIS)考察了传感器对Hg~(2+)的分析性能,实验表明,该传感器能特异地识别Hg~(2+),且在1.0 fM~10.0 pM的Hg~(2+)浓度范围内,阻抗差值(ΔR_(ct))与Hg~(2+)浓度对数(lgC_(Hg)~(2+))呈现良好的线性关系,检出限达到0.16 fM。(3)基于环型寡聚核苷酸(RS)和放大辅助链DNA(AAS)在电极表面反复杂交形成DNA立体杂交网,构建了一种新型高灵敏汞离子电化学传感器。首先将固定链DNA(IS)通过S-Au键固定在金电极表面,再用巯基己醇(MCH)封闭空位点;然后将修饰电极与汞特异寡聚核苷酸(MSO)、桥接链DNA(BS)依次杂交;最后将修饰电极反复和RS、AAS交替杂交形成网状结构,得到高阻抗表面。当Hg~(2+)存在时,MSO和Hg~(2+)形成T-Hg~(2+)-T结构,导致网状结构断裂,从而使得传感器EIS响应信号降低。采用CV、EIS、AFM对传感器构建过程进行了表征,并采用EIS对传感器制备及汞离子分析条件进行优化。实验结果显示,在最佳条件下,该传感器能特异地识别Hg~(2+),且在10.0 aM~1.0 pM的Hg~(2+)浓度范围内,阻抗变化值(ΔR_(ct))与Hg~(2+)浓度对数(lgC_(Hg)~(2+))呈现良好的线性关系,检出限达到7.2 aM。
【学位授予单位】：闽南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.1

【图文】：

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3图 1.1 基于超分支滚环扩增的高灵敏性汞离子荧光传感器示意图[9]2. 基于杂交链反应的汞离子传感器。杂交链反应（Hybridization Chain Reaction ，简称 HCR）[10,11]。激发物一般是一条 DNA 或是其他离子与分子。一般是首先用激发物分子引起探针分子的杂交。激发物引导探针分子（发夹型 DNA）环打开，并杂交形成双链后，杂交后的探针分子有一段处于未杂交状态，用未杂交部分的 DNA 与两种发夹型 DNA 交替杂交，形成两种发夹型 DNA 交替向上的长链。杂交链反应的特点是其对激发物的存在相当敏感。一旦有激发物的存在，则会引发两种发夹型 DNA 之间的反复交替杂交，从而形成长链。所以可将 HCR 用于信号放大检测含量极低的激发物。其次，一旦形成长的杂交链，则长链包含大量的 DNA 双螺旋结构，有利于电活性的双链 DNA指示物的嵌插，从而使杂交链的电化学信号显著放大，进而放大了对激发物的检测信号。

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激发物也可以使用 Hg2+，利用 T-Hg2+-T 结构诱导两条含有较多 T 碱基的 DNA 之间形成双链结构。比如 Huang[12]等人利用 HCR 构建了一种汞离子的传感器。作为激发物的含有较多 T 碱基的 DNAhelper 和构成 HCR 长链的两种发夹 DNA 在没有 Hg2+存在的情况平躺黏附在石墨烯表面。这时虽然环 DNA 上有荧光基团，但是石墨烯会猝灭荧光，所以这种状态下荧光强度最小。一旦 Hg2+出现在溶液中，则 DNA helper 会与一条富 T 碱基的发夹 DNA 通过 T-Hg2+-T 结构形成双链，进而两种发夹 DNA 轮流杂交到杂交链上，最终形成长链。此时一方面因为 DNA 的刚性双链结构，HCR 长链离开石墨烯（荧光猝灭剂），，另一方面荧光基团集中在一条长链上，从而使得荧光信号达到最强（图 1.2）。

【参考文献】