基于功能型纳米材料及生物信号放大技术的新型电化学生物传感器的方法学研究

发布时间：2020-08-20 11:40

【摘要】：高效、灵敏的生物分子定量分析检测技术是现今分析化学研究领域中非常重要的研究课题之一,尤其在临床诊断、食品安全、环境检测等领域备受关注。电化学生物传感器作为一种结合了电化学检测信号与生物识别技术的分析策略,由于其灵敏度高、特异性好、成本低、响应速度快等优点而成为当前分析检测领域的明星研究策略之一,并于近几十年来得到了广大学者的大力发展和研究,取得了较好的应用效果。当前,在电化学生物传感器的研究中,结合性能优异的功能型纳米材料,引入高效、简便、实用性强的信号放大技术,大力发展新型电化学分析手段,在方法学层面开展新型电化学分析技术的研发工作及应用工作,对于提高电化学生物传感器的各项性能,实现对目标生物分子的高效、灵敏、特异性检测具有非常重要的意义。本论文基于多种功能型纳米材料,结合仿酶、核酸介导的生物信号放大策略,在研发高灵敏、低背景、实用性强的新型电化学生物传感器上做了以下方法学层面的部分创新工作:1.基于树枝状DNA-Au@Pt纳米结构和卟啉锰电催化放大技术的超灵敏电化学适体传感器传统的卟啉锰电催化放大体系中广泛使用的催化底物H_2O_2稳定性较差,容易分解,从而对传感器检测结果的准确性及稳定性造成一定的误差。为解决这一问题,我们在实验中发现具有硫醇结构的L-半胱氨酸具有更为稳定的化学活性,可以作为卟啉锰电催化反应的催化底物。基于L-半胱氨酸作为催化底物的卟啉锰电催化反应具有更为稳定的催化反应活性。为了进一步提高该电催化放大反应的放大效率,我们采用自组装树枝状DNA-Au@Pt纳米结构同时固载电活性物质硫堇和仿酶催化试剂卟啉锰,并进一步将组装的复合纳米材料与凝血酶适体链偶联,作为目标物凝血酶的信号探针,用于构建凝血酶电化学适体传感器。通过在自组装树枝状DNA-Au@Pt纳米结构中的Au@Pt纳米颗粒表面固载硫堇,并在其DNA双链结构中嵌入卟啉锰,使得卟啉锰对电解液中加入的催化底物L-半胱氨酸的电催化反应在电活性物质硫堇的表面原位进行,从而实现硫堇电化学信号的有效放大。在此基础上构建新型电化学适体传感器,并应用于对凝血酶的超灵敏分析。2.基于供-受体型光电材料及其信号增强剂复合纳米囊材料的自增强型超灵敏光致电化学生物传感器光致电化学生物传感器为电化学生物传感器的一个重要分支,因其低背景、高灵敏的优点而在近年来备受关注,并得到大力发展。为提高光致电化学生物传感器的灵敏度,可以借助提高光电材料的光电转换效率从而增强传感器的光电流信号的策略。本文构建了一种具有显著提高的光电转换效率的分子内自增强型的光电活性材料,并将之运用于构建自增强型光致电化学传感器。通过制备一种同时大量包裹供-受体型光电活性材料PTB7-Th及其信号增强材料C_(60)纳米颗粒的自增强型纳米囊光电材料,结合目标物双循环放大策略,构建自增强型光致电化学生物传感器,并用于超灵敏检测癌细胞中的microRNA-141。与传统的采用分子间光电子传递方式的光电活性材料相比,本研究所提出的分子内自增强型光电活性纳米囊材料的光电流信号提高了约300倍。构建的自增强型光致电化学生物传感器具有显著提高的光电转换效率,简单的制备方式,优良的稳定性以及检测过程中无需加入其它电子供体、受体或敏化剂的简单的操作步骤,为后续自增强型光致电化学生物传感器的发展开辟了新的方向。3.基于目标物-核酸转换-放大策略及电子隧穿距离调控策略构建通用型比率法光致电化学生物传感器比率法分析技术可以实现复杂生物样本中低背景、高特异性的超灵敏检测。然而,现有的光致电化学传感器中,比率型的分析方法还极为有限。本文基于目标物-核酸转换-放大策略及电子隧穿距离调控策略构建了一种通用型良好的比率型光致电化学生物传感器,显著提高了光致电化学传感器的灵敏度及准确性。采用两种对于特定波长具有选择性响应的光电活性材料CdS量子点(CdS QDs)和SiO_2@亚甲蓝纳米颗粒(SiO_2@MB NPs)同时作为目标物的信号探针,通过目标物-核酸转换-放大策略将输入的单个目标物转换成多个输出核酸(product DNA),并通过product DNA调控电极表面四位体DNA纳米结构的形成,使得信号探针CdS QDs远离电极表面,而信号探针SiO_2@MB NPs靠近电极表面,从而同时得到一个降低的CdS QDs光电流信号以及增强的SiO_2@MB NPs光电流信号。计算两种光电活性材料的光电流信号的比值可以实现对目标物的比率型光致电化学检测。本文所构建的分析方法克服了现有的比率型光致电化学分析方法中目标物对光电材料的高度依赖性,具有良好的通用性,可以广泛应用于如重金属离子,microRNAs,DNAs,蛋白等多种类型目标物的比率型检测,为将比率型光致电化学分析方法应用于环境分析,临床诊断,食品安全以及其他相关领域提供了新的思路。4.基于波长选择性光电活性材料构建同一界面多组分检测型光致电化学生物传感器同一界面多组分检测型分析方法可以有效的提高传感器的检测通量,缩短传感器的检测时间,提高传感器的检测效率。为提高光致电化学生物传感器的检测效率,本文筛选出了两种对于特定波长具有选择性响应的光电活性材料多壁碳纳米管/硫堇复合物和二氧化钛纳米颗粒,并将其分别作为目标物口腔癌核酸及p53核酸的光电活性探针构建同一界面多目标物同时检测型光致电化学分析技术,并将之应用于药物刺激下癌细胞中口腔癌核酸及p53核酸的体外检测。采用酶辅助的目标物循环放大策略进一步提高检测方法的灵敏度。为探讨所构建的多组分分析型光致电化学生物传感器对于实际样本的分析性能,实验采用构建的传感器进一步对药物姜黄素刺激下的HeLa细胞中口腔癌核酸及p53核酸的含量进行定量检测。本研究虽然仅仅以两种核酸类物质作为检测的目标物模型探讨所构建的光致电化学生物传感器同一界面多目标物的分析性能,但本方法亦可适用于其他如蛋白、细胞、重金属离子等目标物的同一界面多目标物同时检测,为同一界面多目标物同时分析型光致电化学分析方法的建立开辟了新的方向。5.基于近红外光调控型光致电化学细胞表面蛋白分析技术及其体外药物筛选应用研究现有的药物研发技术成本高昂,却收效甚微。美国食品药品管理局提出:在药物研发的早期阶段,发展更为灵敏、准确、有效的体外药物筛选技术是解决这一问题的关键。灵敏度高、背景信号低、便捷、低廉的光致电化学生物分析技术具有极大的潜在应用价值,然而其检测效率、检测条件的生物相容性以及检测方法的灵敏度等方面尚需进一步改进。为解决以上问题,本文构建了一种可以应用于细胞表面多种蛋白同时分析的光致电化学分析技术,通过在近红外光作用下同时高效检测活细胞表面的凋亡指示因子磷脂酰丝氨酸蛋白(Pho)及稳定表达的钠钾三磷酸腺苷酶蛋白(Sat)实现体外药物筛选。通过组装在近红外光源下光电流信号逐渐较低的信标探针(Tag_(kinetic))以及信号稳定不变的信标探针(Tag_(stable))用以分别指示Pho和Sat的含量,并对检测到的混合光电流信号进行数学解析,可以同时实现对细胞表面蛋白Pho和Sat含量的检测。计算待筛选药物刺激下癌细胞表面Pho和Sat的数量比实现药效评估及体外药物筛选的目的。本文所构建的方法不仅克服了现有的光致电化学多目标物检测技术中较差的生物相容性及实用性,更重要的是,我们所构建的方法克服了现有基于荧光检测的体外药物筛选标准方法中荧光标记探针难以避免的光漂白性及交叉反应的缺点,展现了显著提高的准确度及灵敏度,为构建超灵敏、高准确度、可操作性强、实用性好且成本低廉的体外药物筛选技术提供了一条全新的道路。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.1
【图文】：

示意图,电化学生物传感器,工作原理,示意图

域的不断进步，发展具有更高的灵敏度、更快的响应速度、更高的检测效率以及更为便捷的检测流程的电化学生物传感器成为了其发展过程中的重要目标和挑战[5-7]。在电化学生物传感器的研究中，构建高效的检测设备和检测模式，发展新型的电化学检测技术，结合具有独特功能的前沿纳米材料及高效、便捷的生物信号放大技术，对于提高电化学生物传感器的实用性、灵敏度等各项性能具有重要的意义。1.1 电化学生物传感器电化学生物传感器是一门结合了电化学分析技术与生物学技术所发展起来的学科[8, 9]。由于融合电化学、医学、生物科学、纳米技术等众多前沿科学，电化学生物传感器在近年来得到了飞速的发展，具有较高的灵敏度、良好的特异性、快速的响应速度、便捷的检测方式、低廉的设备成本等优点。电化学生物传感器是依据生物传感器中换能器的不同而进行分类所产生的一个重要研究学科。如图 1.1 所示，简单来说，电化学生物传感器的工作原理是利用固载在传感界面的生物识别原件对目标物进行特异性识别，并通过工作站将生物识别信号转换成为电流、电阻、电位、电容等可以检测的输出信号，从而实现传感器对目标物的特异性检测[10]。

示意图,电化学生物传感器,方波伏安法,构建原理

于方波伏安法的电化学生物传感器用于检测两种目标物的构建原理tration of the aptamer/quantum-dot-based dual-analyte biosensor. Copyri抗型电化学生物传感器阻抗谱（electrochemicalimpedancespectroscopy，EIS）又叫学阻抗谱的测定中，通过给电化学系统施加不同频率的小振定交流信号电压与电流间的比值（阻抗）随正弦波频率的变阻抗技术可以分析电极过程的动力学、研究电极表面材料质等。近年来，电化学阻抗谱作为一种飞速发展的电化学检化学生物传感器构建过程中传感界面的表征以及传感器对[32, 33]。如图 1.5 所示，贾能勤教授课题组研究并报道了一种胞传感器用于检测癌胚抗原阳性肿瘤细胞。采用一种三维（Au@BSA）微球修饰传感界面以进一步结合癌胚抗原阳性

示意图,电化学生物传感器,构建原理,交流阻抗法

第一章绪论抗体。由于 Au@BSA 微球具有良好的导电性，传感器的起始阻抗值较低，而当目标物存在时，目标物细胞被传感器表面的特异性抗体捕获到电极表面，使得传感界面的阻抗升高。通过检测传感界面阻抗的大小实现对目标物的检测。传感器对目标物细胞的检测范围为 5.2×10 ~ 5.2×107cell/mL[34]。

【参考文献】