牛奶中主要有害污染物的表面增强拉曼光谱检测方法研究

发布时间：2020-09-04 09:33

　　随着牛奶消费量的增加,牛奶中有害物污染受到了消费者的极大关注。常规的检测方法或费时费力,或处理复杂、仪器昂贵、均不适用现场快速检测,因而开发新型分析方法已成为牛奶检测领域的研究热点。表面增强拉曼光谱技术(SERS)具有样本前处理简单、检测速度快、灵敏度高、光谱信息丰富、易操作等优点。因此,本研究以牛奶中三种主要有害污染物食源性致病菌、抗生素、重金属离子为检测对象,尝试将SERS技术与现有技术相结合,克服常规检测方法的局限性,实现牛奶中有害污染物的快速高灵敏检测。主要研究内容如下:1.牛奶中食源性致病菌的SERS检测方法研究。研究提出了一种基于粒距调控的竞争免疫SERS检测新方法,以鼠伤寒沙门氏菌为检测对象,首先制备了长径比适中、拉曼增强效果明显的金纳米棒(GNRs)作为SERS基底,然后通过静电吸附作用将鼠伤寒沙门氏菌特异性核酸适配体吸附至对巯基苯胺(PATP)修饰的GNRs表面;该核酸适配体保护GNRs在盐离子环境下的单分散状态,PATP作为标记分子报告SERS信号;当目标物与核酸适配体互补DNA共同存在时,它们竞争性地与核酸适配体发生特异性结合,导致核酸适配体失去对GNRs的保护,GNRs粒子间距减小,拉曼信号增强,以此实现检测。实验结果表明,鼠伤寒沙门氏菌线性检测范围为56-56×10~7 cfu/ml,检测限为9 cfu/ml;同时,对实际牛奶样本以标准加入法进行鼠伤寒沙门氏菌检测,加标回收率为98%-126%。研究表明,基于粒距调控竞争性免疫SERS方法检测牛奶中食源性致病菌思路是可行的。2.牛奶中抗生素残留的SERS检测方法研究。研究提出了一种竞争磁免疫SERS检测新方法,以四环素为检测对象,首先制备了磁性饱和度高、颗粒大小均一的磁性纳米微球,然后将其与四环素特异性核酸适配体结合,作为捕捉探针,用于四环素的捕获;PATP修饰的金纳米球/二氧化硅核壳材料与核酸适配体互补DNA结合,作为信号探针。当四环素存在时,四环素与捕捉探针上核酸适配体发生特异性结合,从而引起不同浓度信号探针在外磁场作用下的释放,通过测定被释放信号探针的拉曼光谱,根据PATP特征峰位置获取拉曼光谱强度,建立其与四环素浓度关系的标准曲线,实现检测。实验结果表明,四环素线性检测范围为0.001-100 ng/mL,检测限为0.001 ng/mL;同时,对实际牛奶样本以标准加入法进行四环素检测,加标回收率为97%-120%。研究表明,基于竞争磁免疫SERS方法检测牛奶中抗生素残留思路是可行的。3.牛奶中重金属离子的SERS检测方法研究。研究提出了一种基于罗丹明衍生物R开环反应的SERS检测新方法,以重金属汞离子为检测对象,首先制备了颗粒大小均一、拉曼增强效果明显的金/银核壳纳米立方块作为SERS基底,然后将其与罗丹明衍生物R结合,作为捕捉探针,用于重金属汞离子的捕获。当汞离子存在时,汞离子与罗丹明衍生物R分子结构中螺环部位发生开环反应,并发生螯合作用,实现汞离子的捕获;通过测定加汞后混合物的拉曼光谱,建立特征峰拉曼光谱强度与汞离子浓度关系的标准曲线,实现检测。实验结果表明,汞离子线性检测范围为0.01-1000 ppm,检测限为5.16 ppb;同时,对实际牛奶样本以标准加入法进行汞离子检测,加标回收率为98.83%-110%。研究表明,基于罗丹明衍生物R开环反应的SERS方法检测牛奶中重金属离子思路是可行的。4.基于SERS和化学计量学的牛奶有害污染物快速检测方法研究。在前三章研究基础上,进一步探索了更为快速便捷的检测方法,以满足牛奶中有害污染物现场快速检测的需求。研究仍以重金属汞离子为检测对象,首先优选出金纳米球/二氧化硅作为SERS基底,将其与不同浓度梯度的重金属汞离子混合,测其拉曼光谱;然后运用卷积平滑-一阶导数法对光谱进行预处理,消除基线偏移、漂移和噪声干扰的影响;接着分别利用遗传算法(Genetic Algorithm,GA)和蚁群算法(Ant Colony Optimization,ACO)优选出预处理后拉曼光谱的特征变量;最后有比较地利用两种线性(MLR与PLS)和两种非线性(BPANN与BP-Adaboost)算法建立了汞离子定量检测模型。实验结果表明,ACO优选BP-Adaboost模型对汞离子含量预测结果最佳,预测集相关性系数为0.997,预测集均方根误差为0.092;同时,对实际牛奶样本以标准加入法进行汞离子检测,加标回收率为98.3%-115%。研究表明,基于SERS和化学计量学方法检测牛奶中重金属离子思路是可行的。5.基于SERS/荧光双模态体系的牛奶有害污染物检测方法研究。在前四章研究基础上,进一步探索了SERS/荧光双模态检测新思路,以提高检测方法的广谱适用性。研究仍以重金属汞离子为例,首先利用制备的磁性纳米微球与汞离子特异性核酸适配体结合,作为捕获探针,用于汞离子的捕获;优化制备金银/石墨烯-上转换纳米复合材料与汞离子核酸适配体互补DNA结合,作为双模态信号探针。当汞离子存在时,汞离子与捕捉探针上核酸适配体发生特异性结合,从而引起不同浓度信号探针在外磁场作用下的释放,随后测定上清液中信号探针拉曼及荧光光谱,分别建立拉曼/荧光强度与汞离子浓度关系的标准曲线,实现双模态检测。实验结果表明,基于SERS技术的汞离子线性检测范围为0.001-800 ppm,检测限为0.32 ppb。基于荧光光谱技术的汞离子线性检测范围为0.001-100 ppm,检测限为0.001 ppm;同时,对实际牛奶样本以标准加入法进行汞离子检测,加标回收率分别为99.23%-110%和96.98%-109%。研究表明,基于SERS/荧光技术的双模态方法检测牛奶中重金属离子思路是可行的。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TS252.7;O657.37
【部分图文】：

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曼技术与纳米技术结合，以构筑的SERS金属纳米基底材料调控信号增强，与拉比，该技术具有更高的灵敏度以及光谱分辨率，能够实现1014倍单分子拉曼信号在痕量物质检测上具有更大的应用潜力[84, 85]。SERS现象首次出现于1974年，英 Fleischman等[86]发现吸附在粗糙化银电极上的吡啶分子具有很强的拉曼散射效应号强度随着周围电场电位的变化而变化，但是当时他们把这种现象归因于粗糙电引起的吸附分子量的增多，从而导致吡啶分子拉曼信号的增强。直到1977年，Je过进一步深入的研究与总结，发现粗糙电极上吸附的吡啶分子相较于光滑电极上曼信号强度最高可增强106倍，他们意识到这种增强来自一种与粗糙表面相关的，而不是简单的吸附分子的增多。因此，他们提出了电磁增强效应也就是SER制。随后，Albrecht和Creighton[88]发现在粗糙纳米基底诱导的SERS信号增强过程荷转移效应，即化学增强机制。目前，对SERS的增强机理没有统一的观点，其理和化学增强机理是普遍认同的两种拉曼信号增强机制，SERS信号物理增强和被发现后，很快在食品检测分析方面得到广泛应用。

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图 1-2 SPR 模型示意图[90, 91]Figure 1-2 The schematic diagram of SPR model 化学增强机制学增强机制则是从金属表面和吸附分子间的电荷转移角度来解释SERS信号增当被测分子通过化学键的作用与SERS基底材料结合时，在激光照射下，吸附分发生电荷转移，影响分子表面的电子云密度，进而引起分子极化率的改变，从而信号大大增强[99]（图 1-3）。研究学者通过测定吡啶与金属基底复合物的高分辨谱（HREELS）确认了吡啶与金属基底发生吸附作用时电荷转移峰的存在，进而强理论中电荷转移现象存在的真实性[100, 101]。主要的化学增强理论模型包含电荷位模型以及分子-金属成键模型。1）电荷转移模型认为，目标分子与金属SER键连接方式结合，该复合物在激发光照射下，电子将由金属基底表面转移到目标轨道上，金属费米能级上的电子因吸收了光子向更高能级跃迁，亦或者从目标分

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江苏大学博士学位论文属基底未占据的轨道。当电子回到金属表面时，释放拉标分子拉曼光谱信号大大增强[102, 103]。2）活位模型认接的分子都能产生信号增强效应，只有那些与金属SER子才能产生该效应[104]。3）分子-金属成键模型认为，，能够通过化学键连接，从而导致该复合物产生较大的，该模型认为目标分子与金属基底的成键，是产生SE离变大时，成键断裂，该效应也随之消失[92, 105, 106]。

【参考文献】