酶辅助的微生物电合成系统的构建与优化

发布时间：2020-10-16 19:14

　　 二氧化碳过量排放会导致气候变化和环境破坏。微生物电合成是一种较有前途的、可持续的技术,可以通过向微生物提供电能来形成细胞内还原当量,从而还原二氧化碳并合成燃料和化学品,如氢、醇和碳氢化合物等。许多产乙酸菌可以通过直接接触的细胞外电子传递机制直接从电极上吸收电子,从而形成细胞内还原力,将二氧化碳转化为乙酸。然而,这些产乙酸菌的基因组编辑方法尚未建立,这极大地阻碍了可合成产品的多样性。为了克服这一缺点,能实现基因组编辑的非电活性细菌(例如罗尔斯通氏菌Ralstonia eutropha H16)可以被引入,因为它可以通过电子载体(如还原氧化还原染料)间接吸收电子来获得胞内还原力。为了避免反应性氧物种抑制细胞生长,我们首先采用了双室生物电化学反应器,其中阴极室的罗尔斯通氏菌被质子交换膜与阳极室隔离开来,这样阳极产生的反应性氧物种无法穿透质子交换膜到达阴极。其次,我们构建了酶辅助微生物电合成系统,将甲酸脱氢酶与中性红介导的微生物电合成系统结合。这一方面大大降低了过电势,只需要提供-0.6 V的恒电位就可以驱动微生物电合成系统,大量节省了电能。另一方面,酶催化形成的甲酸和中性红都可以作为电子载体供给细胞内还原力,这种“双管齐下”的电子传递模式极大地加速了从阴极到罗尔斯通氏菌的电子传输。第三,我们在宿主菌株罗尔斯通氏菌中异源表达了来自细长聚球藻PCC7942的关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶,有效地提高了开尔文循环的效率,从而有效提高了CO_2的固定速率和聚羟基丁酸酯的产率。这项研究设计出一种新的构建高效的微生物电合成系统的方法,有效地实现将二氧化碳转化为聚羟基丁酸酯。一方面,我们通过将甲酸脱氢酶加入到我们的微生物电合成系统中来加速电子从工作电极到微生物的传输,这大大提高了PHB的产量(378 mg/L)。另一方面,我们通过将CBB循环中的关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶引入到罗尔斯通氏菌H16,最高的PHB产量达到472 mg/L,比对照菌(PHB产量为164 mg/L)高出1.9倍。
【学位单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O633.14;O646;Q939.9
【部分图文】：

图 1-1 Clostridia 中化学品的合成代谢路径Figure1-3 Synthetic pathways for chemicals production in Clostridia. Abbreviations: PTA:phosphotransacetylase; AK: acetate kinase; AAD: alcohol/aldehyde dehydrogenase; ADH: alcoholdehydrogenase; AOR: aldehyde:ferredoxin oxidoreductase; THL: thiolase; HBD:3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; CRT: crotonase; BCD: butyryl-CoA dehydrogenase; PTB:phosphotransbutyrylase; BK: butyrate kinase; CoAT: CoA transferase; AADC: acetoacetatedecarboxylase; PFOR: pyruvate:ferredoxin oxidoreductase; LDH: lactate dehydrogenase; ALS:acetolactate synthase; ALDC: acetolactate decarboxylase; 23BDH: 2,3-butanediol dehydrogenase除了产乙酸菌外，还有一些产甲烷菌（Methanobacterium palustre，Methanococcus maripaludis）[104-106]和其他一些细菌（Geobacter sulfurreducens，Desulfovibrio paquesii 和 archaeon）[107, 108]也可以应用于 MES 中。G. sulfurreducens不能使用 CO2作为唯一的碳源，但它可以消耗琥珀酸还原 CO2为甘油[109]。G.sulfurreducens 的微阵列分析显示，电子在从 G. sulfurreducens 生物膜到阳极的转移过程中，细胞色素和菌毛等基因高度表达。但是电子从阴极到 G. sulfurreducens

第 1 章 绪论依赖型的 FDH 催化 CO2产生甲酸，随后，R. eutropha 同化甲酸产生 PHB（途径II，图 1）。因此，甲酸和 NR 都可以作为电子载体，可以显著地促进电子从阴极向 R. eutropha 的传递。另一方面，我们对与 R. eutropha 兼容的启动子进行了优化，并筛选出 pBAD 启动子能够有效诱导基因的表达强度，并且我们首次将来自细长聚球藻 PCC7942 的高效的 Rubisco 引入到 R. eutropha H16 中来合理地设计CBB 循环增加 CO2固定。

图 2-1 Gibson 组装法的克隆原理Figure 2-1 Cloning Principle of Gibson Assembly Method表 2-9 Gibson 组装中 mixture 组成体系Table 2-9 Components of mixture in Gibson assembly成分 体系（μL）5×isothermal reaction buffer 8T5 exonuclease (0.2 或 1.0 U/μL) 0.8Taq DNA Ligase (40 U/μL) 4Phusion DNA polymerase (2U/μL)0.5表 2-10 Gibson 组装中 isothermal reaction buffer 组成体系Table 2-10 Components of isothermal reaction buffer in Gibson assembly成分 体系
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本文编号：2843658