低共熔溶剂双水相体系用于生物大分子的分离分析研究

发布时间：2020-10-22 12:59

　　 由于合成简易、成本低廉,低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent,DES)在众多领域得到广泛应用,尤其是应用于双水相体系(Aqueous Biphasic Systems,ABSs)。双水相体系是由两种水相溶的物质在一定浓度下分层形成,能够提供相对温和的环境,是一种绿色可持续性和环境友好型体系。通过大量的研究发现,基于低共熔溶剂的双水相体系不仅萃取性能良好,而且能够保证分析物的完整性,使得分析物在萃取前后不会发生变性失活等现象。此外,该体系制备简单,易于大批量工业化生产。蛋白质和核酸是研究生命活动的重要物质,所以通过分离纯化制备其纯品显得至关重要。色素在纺织工业和食品工业等方面应用广泛,准确快速地检测违禁色素含量是保证食品安全的重要措施。本文成功合成各种新型低共熔溶剂,并结合新的成相盐构建一系列低共熔溶剂双水相体系,进一步探究了该体系萃取牛血清白蛋白、RNA和苋菜红的性能。主要研究内容如下:(1)基于二元和三元的低共熔溶剂双水相体系萃取分离蛋白质本研究对比了二元和三元低共熔溶剂应用于双水相体系萃取分离蛋白质的性能差异,以牛血清白蛋白(BSA)作为目标蛋白进行萃取机理的探究。选用四甲基氯化铵(TMAC)作为氢键受体合成了四种二元和四种三元低共熔溶剂。通过相图可以发现二元低共熔溶剂的成相能力强于三元低共熔溶剂。其次,对比两者萃取能力可以发现,三元低共熔溶剂的萃取能力更佳。然后,选取四甲基氯化铵-尿素和四甲基氯化铵-尿素-甘油进行单因素实验,包括DES的质量、盐浓度、牛血清白蛋白的质量、温度和pH。优化萃取条件后,二元和三元低共熔溶剂的最佳萃取效率高达99.31%和98.95%。但反萃取实验证明了三元低共熔溶剂具有更大的优势,反萃取效率为71.89%,而二元低共熔溶剂仅为21.02%。最后,运用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、圆二色谱(CD)、动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)进行了萃取机理的研究。所拟方法表明三元低共熔溶剂结合双水相体系萃取蛋白质具有一定的优势,为设计功能化低共熔溶剂提供了新思路。(2)基于聚乙二醇的低共熔溶剂双水相体系萃取分离RNA合成了16种基于聚乙二醇(PEG)和季铵盐的新型低共熔溶剂,结合双水相体系萃取分离RNA。全面评估了氢键供体的分子量和含量、氢键受体的碳链长度和阴离子种类、成相盐的种类对成相的影响。其次,通过萃取RNA可以发现,PEG含量和分子量越小、季铵盐碳链长度越长和成相盐的疏水性越强越有利于萃取。然后,选取基于四丁基溴化铵(TBAB)/聚乙二醇600(PEG 600)合成的低共熔溶剂[TBAB][PEG600]和Na_2SO_4的体系进行单因素实验,在最佳萃取条件下,RNA的萃取效率达到99.76%左右,且表明静电作用是萃取RNA的主要驱动力。因此,通过调节离子强度可以使得反萃取效率达到85.19%到90.78%。此外,选择性萃取实验证明了86.19%RNA集中分布在下相,72.02%色素(Trp)主要分布在上相。最后,利用动态光散射和透射电镜进一步考察了萃取RNA的机理。本实验提出了低共熔溶剂双水相体系绿色高效萃取RNA的方法。(3)基于聚丙二醇的低共熔溶剂双水相体系萃取分离苋菜红本实验运用聚丙二醇400(PPG 400)和四丁基溴化铵(TBAB)合成低共熔溶剂,选择不同种类的新型盐作为成相剂构建低共熔溶剂双水相体系,例如季铵盐、氨基酸和多元醇。通过相图可以发现,在所研究的成相盐中多元醇类的盐成相能力稍逊色于其他种类的盐。此外,盐的碳链长度越短,越有利于促进相分离。选取疏水性不同的三种色素作为分析物,探究疏水性对于低共熔溶剂/PPG 400和盐溶液构建的双水相体系萃取效果的影响,结果表明色素疏水性越强越有利其富集在低共熔溶剂相。另一方面,盐的成相能力下降,所有体系萃取能力也随之下降。据此,运用PPG 400和甜菜碱的双水相体系选择性萃取分离色素,可以发现93.00%苏丹红Ⅲ分布在上相,而80.00%左右的日落黄和苋菜红趋向于富集在下相。进一步选用DES/甜菜碱体系进行单因素实验和反萃取实验,优化萃取条件后有98.00%的苋菜红可以被萃取到上相,只有67.98%的苋菜红能被反萃取到下相。最后,运用动态光散射和透射电镜进行萃取机理的探究,结果表明疏水性是萃取色素的主要驱动力。本实验致力于开发新型成相盐,并设计了环境友好型萃取色素的方式,促进了双水相体系在检测食品色素方面的进一步发展。
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O629.7;O658
【部分图文】：

换言之，可通过改变组分控制低共熔溶剂的熔点。图1.1 四丁基溴化铵-尿素低共熔溶剂的合成路径1.1.3.2 粘度粘度是衡量液体粘性大小的参数，而粘性指的是液体处于流动状态时产生内摩擦的性质，所以通过粘度大小可表征与液体性质相关的阻力因子。根据文献可知，决定粘度大小的主要因素是液体中的氢键和范德华力[25]。液体的粘度(包括低共熔溶剂)可选用旋转式粘度计等仪器测定。通常来说，低共熔溶剂的粘度在 10 到 700 mPa·s 之间，而大多数的低共熔溶剂的粘度大于 100 mPa·s，导致这一现象的主要原因是：一方面低共熔溶剂中存在复杂的氢键网络，不同阴阳离子之间的静电作用力存在差异；另一方面，低共?

能够稳定存在且不会失活。因此，双水相萃取技术已经广泛地应用于多种生物分子的分离分析，包括蛋白质、酶、核酸、多肽等。其分离过程如图 1.2 所示。图1.2 双水相体系萃取分离过程1.2.2 双水相体系的相图双水相体系的相图是直观判断不同浓度的组分能否形成两相的重要手段。相图的横纵坐标由两组分的梯度质量分数构成。如图 1.3 所示，图中曲线称为双节线，代表 A 物质和 B 物质形成双水相体系时的相图。曲线以上的区域是两相区，该区域内的任意一点所对应的组分含量均可构成一个双水相体系；曲线以下的区域是均相区。图中的 Y 点表示体系的组成情况，其中，a 和 a`代表平衡时的上下相。直线aYa`称为系线，该线上的各点具有相同的组成，但是两相的体积比不同。a 相和 a`相的质量之比与 Ya`和 Ya 的线段长度之比相等。当系统的组成情况由 Y 点移动到Y`时，系线长度缩短，体系之间的组成差相应地变小。直到 Y 点移动到 C 点，即到达临界点。相图中的临界点是由实验测得，实验中通过改变成相组分的质量，记录使体系恰好成相时的浓度

相体系的成相，甚至有时可以决定该体系是否能够形成双水相。特别是在临界点附近，温度对体系的影响最明显。图1.3 双水相体系的相图作为一阵高效的抗生素，青霉素虽然其生产技术趋于成熟，但依然存在可改良之处，特别是萃取提纯方面面临青霉素降解损失等问题。因此，双水相技术萃取分离青霉素具有一定的优势。Jiang 等人结合终端改性的聚合物(聚乙二醇)构建新型双水相体系，达到相分离平衡后，大约 95.8%以上的青霉素可以转移到咪唑基终端化的聚合物富集相。通过引入疏水性的离子液体，调节溶液的 pH 至碱性环境，成功将该聚合物从双水相体系中分离出来。最后，调节溶液至弱酸性(pH 5.5-6)，可以将聚合物和疏水性离子液体彻底分离[67]。运用聚乙二醇修饰蛋白质有利于优化其物理化学性质和动力学性能。然而，聚合反应的产物中存在未反应的蛋白质和聚合物的偶联剂等
【参考文献】

相关博士学位论文 前1条

1 谭婷;低共熔溶剂的制备及其在一些食品和中药分析中的应用研究[D];南昌大学;2016年

相关硕士学位论文 前2条

1 郭武杰;季铵盐离子液体分离油酚混合物及机理[D];北京化工大学;2013年

2 张红艳;离子液体体系中磷酸盐分子筛的合成及其特性[D];太原理工大学;2007年

本文编号：2851632