几类含铁酶催化机理的理论研究

发布时间：2020-10-24 11:34

　　 酶是由活细胞产生的具有催化功能的生物大分子,相比于一般催化剂,酶具有很多优点,如高活性、专一性、活性可调控性等。许多酶的活性中心需要结合金属离子才能发挥其催化活性,常见的金属离子有Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Co2+和Ca2+等。含铁酶是常见的金属酶,其中包括双加氧酶(邻苯二酚氧酶等)、单加氧酶(细胞色素P450酶、甲烷单加氧酶等)、过氧化物酶、过氧化氢酶、歧化酶等。由于酶的催化反应非常迅速,仅仅通过实验手段弄清催化反应中涉及的中间体和过渡态的结构尤其是电子结构还存在许多困难,对催化反应的详细机制缺乏系统理解。随着理论化学方法的发展,计算化学可以从原子层面对酶的反应机理进行深入研究,其研究结果可以与实验工作相互补充和验证,在酶催化机理研究方面显示出越来越大的优势。本论文主要采用分子动力学模拟及量子力学与分子力学相组合的(QM/MM)方法对几类含铁酶的催化机理进行了深入的理论研究,通过计算获得了反应过程中涉及的中间体和过渡态的结构,并基于对反应势能面分析确定了催化反应的最优路径,在原子水平上阐明了这些酶催化反应的特点和立体选择性、区域选择性规律,对一些重要残基对酶催化活性的影响给出了理论解释或预测,为深入理解这些酶的生物学功能、实验研究及酶工程奠定了一定的理论基础。论文工作主要包括:(1)色氨酸裂解酶(NosL)催化胺脱氢反应以及羧基转移反应的QM/MM研究L-色氨酸裂解酶(NosL)属于S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)依赖酶,它主要催化L-色氨酸转化为3-甲基吲哚酸(MIA)。在2014年报道的晶体结构(PDB编码:4R34)的基础上,本文用QM/MM方法对NosL酶的反应机理进行研究,催化反应过程包括底物氨基脱氢,C-C键断裂和羧基迁移。计算结果表明,夺氢反应存在区域选择性,发生在底物的氨基氢位置,伴随的反应能垒为12.4 kcal/mol,对接下来反应的两条路径(path1和path2)进行深入研究,Cα-Cβ键断裂和Cα-C键断裂对应的能垒分别为7.2 kcal/mol和15.0 kcal/mol,Cα-Cβ键更容易断裂是由底物的氨基自由基的电子空穴离域引起的。通过理论计算,确定了实验上观察到的中间体源于Cα-C键的断裂,而且Cα-C键的断裂和羧基自由基的迁移是协同发生的,这和实验上的EPR电子捕获分析结果是一致的,并可以解释实验中没有观测到羧基自由基的现象。副产物(3-甲基吲哚)的生成来自于Cα-Cβ键的断裂,副产物的生成伴随的能垒为19.5 kcal/mol。然而,主产物3-甲基吲哚酸的生成为决速步,对应的能垒为26.9 kcal/mol。我们的计算结果可以很好地阐述NosL酶的催化机理,并对以后研究SAM酶家族有重要作用。(2)烟曲霉毒素B内过氧化酶(FtmOx1)催化环氧化反应的QM/MM研究FtmOx1是首次报道出可以催化底物烟曲霉毒素B转变成疣孢青霉原的依赖α-酮戊二酸的单核非血红素含铁酶。氧气分子与底物发生反应生成疣孢青霉原,并没有发生O-O键断裂,这与目前所知的其他非血红素含铁酶是不同的,但是目前具体的机理还不明确。本文在FtmOx1酶与α-酮戊二酸或与底物共结晶的晶体结构的基础上,构建了酶-α-酮戊二酸-底物的模型,并用QM/MM方法阐明FtmOx1酶的催化机理。计算结果表明,五重态的FeIV=O复合物是基态。FeIv=O复合物首先夺取228号酪氨酸残基的羟基上的氢,反应能垒是9.1 kcal/mol。如果FeIV=O复合物直接从底物的C21夺取氢,能垒会升高到33.9 kcal/mol。将228号酪氨酸突变成丙氨酸时,能垒会升高到24.0 kcal/mol。接下来的反应是,产生的酪氨酸自由基从底物C21上夺取氢(H2),能垒是23.8kcal/mol。第二分子氧气进入活性中心并与底物的C21自由基结合,完成环氧化反应,反应能垒是4.8 kcal/mol。本文得到的结论可以为FtmOx1酶反应机理的研究提供有用的信息,并对进一步的实验研究有引导作用。(3)细胞色素P450酶CYP162C2(PntM)催化戊丙酯菌素F氧化重排机理的理论研究CYP162C2(PntM)属于细胞色素P450酶,它可以催化类倍半萜烯抗生素异丙酯菌素的生物合成。戊丙酯菌素F氧化重排为异丙酯菌素的反应过程包括:戊丙酯菌素F的H-1si转移,2si位甲基转移以及异面H-3re的失去。计算结果表明,第一步的H-Isi转移是催化反应的控速步,能垒为20.3kcal/mol,这与实验上的关于反应能垒的结果(18.5～18.7kcal/mol)是一致的。氢转移后,空间位阻阻碍了和血红素相连的羟基回弹到底物的C1位置,这不同于普通的P450酶。最后一步的异面失氢(H-3re)过程是卟啉环上的羧基通过水桥完成的。通过对中间体的不同位置选择性脱氢,可以生成三种异构化产物(戊丙酯菌素A,B和P),分别对应着三种不同的路径。为了深入研究PntM酶的催化机理,我们进一步对底物类似物的反应机理进行研究,结果表明底物类似物对催化反应的氧化重排过程影响很小,我们猜测底物类似物可能会对酶的结合过程产生影响。(4)泛酸依赖单氧酶水杨酸羟化酶的催化机理的研究水杨酸水解酶(SALH)属于泛酸依赖的单氧酶,它可以催化水杨酸通过羟基化和脱羧反应转化为邻苯二酚。在晶体结构(PDB编码:5evy)的基础上,本文用QM/MM方法对SALH的反应机理进行深入研究。通过理论计算,对之前提出的反应机理进行了修正,整个酶催化反应包括两个关键步骤,FAD的C4a-羟基首先攻击底物的C1位置,随后,该中间体发生脱羧反应形成邻苯二酚,然而在SALH酶之前提出的机理以及它的类似酶(PHBH和MHBH)中,FAD的C4a-羟基首先进攻的是底物的C3位置。去质子化的底物是活性形式,可以很容易地转化为邻苯二酚,然而中性的底物对应着很高的反应能垒(39.8 kcal/mol),这与实验上测得反应最佳的pH为7.6的实验结果是一致的。对于去质子化的底物,羟基化和脱羧过程是分步进行的,其中脱羧过程的能垒为14.5 kcal/mmol,是催化反应的决速步骤。我们用不同的泛函(B3LYP,BP,BVMN,PBE,M06和TPSSH)进行反应机理的计算,这些不同泛函的实验结果是相似的,这些结果都表明该催化反应是高放热过程,这与SALH酶的相似酶(PHBH)结果是一致的。本论文的创新之处:(1)通过对SAM自由基酶NosL的催化机理的深入研究确定了 Ado自由基夺氢反应的区域选择性,给出了夺氢后底物L-色氨酸发生裂解及羧基迁移过程的多种可能路径,从理论上预测的反应的主产物和副产物与实验观测结果相吻合,系统阐明了 NosL酶催化反应的机制。(2)深入研究了依赖α-酮戊二酸的烟曲霉毒素B内过氧化酶(FtmOx1)的催化机理,通过对多种自旋态的研究确定了反应物的初态及反应过程电子结构的演化规律,阐明了 FtmOx1催化反应的机制,为此类酶的实验研究提供了重要参考。(3)对细胞色素P450酶(PntM)进行了深入研究,充分考虑了铁中心自旋态变化对催化活性的影响,给出了 PntM酶无法进行氧回弹反应的根本原因,阐明了主要产物及异构化副产物生成机制,计算结果对戊丙酯菌素的生物合成有一定的指导意义。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O629.8;O643.31
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 酶的概述
        1.1.1 酶的概念及特点
        1.1.2 酶的催化机制
        1.1.3 酶促反应动力学
    1.2 酶的应用前景
    1.3 本论文的研究目的
    参考文献
第二章 理论基础和计算方法
    2.1 量子化学方法
    2.2 分子动力学方法
    2.3 量子力学与分子力学（QM/MM）组合方法
    参考文献
第三章 色氨酸裂解酶的理论研究
    3.1 前言
    3.2 计算方法
        3.2.1 计算模型
        3.2.2 QM/MM计算
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 酶-底物复合物的结构
        3.3.2 反应机理
        3.3.3 残基静电分析
    3.4 结论
    参考文献
第四章 烟曲霉毒素B内过氧化酶的理论研究
    4.1 前言
    4.2 计算方法
        4.2.1 模型构建
        4.2.2 QM/MM计算
    4.3 结果与讨论
IV=O复合物的结构'>        4.3.1 Fe^IV=O复合物的结构
        4.3.2 反应物的自然轨道
        4.3.3 氢抽取反应
        4.3.4 底物脱氢和环氧化
    4.4 结论
    参考文献
第五章 细胞色素P450酶CYP161C2的理论研究
    5.1 前言
    5.2 计算方法
        5.2.1 动力学模拟
        5.2.2 QM/MM计算
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 Cpd I的结构
        5.3.2 反应路径
        5.3.3 底物类似物的结果
    5.4 结论
    参考文献
第六章 水杨酸水解酶的理论研究
    6.1 前言
    6.2 计算方法
        6.2.1 模型
        6.2.2 QM/MM方法
    6.3 结果和讨论
        6.3.1 优化的反应物
        6.3.2 SALH与中性底物的反应机理
        6.3.3 SALH与去质子化底物的反应机理
    6.4 结论
    参考文献
硕士期间发表论文
致谢
附已发表论文
学位论文评阅及答辩情况表

【参考文献】

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1 刘文剑;;新一代相对论量子化学方法[J];中国基础科学;2007年02期

2 陈红霞;酶工程与抗生素工业[J];国外医药(抗生素分册);2005年06期

3 薛璐,马莺;透性化海藻糖合酶的研究[J];食品与发酵工业;2002年01期

本文编号：2854408