菌果聚糖合成酶和水解酶的异源表达、分子改造及其偶联催化研究

发布时间：2020-10-24 16:25

　　 近年来,随着大众健康意识的增强,对人体具有重要免疫调节作用的益生元产品受到越来越多人的青睐。作为重要的益生元和功能性食品,果寡糖浆具有很多优良的特性,如甜度高、吸湿性强、渗透压强等特点。另外,果寡糖浆不含有葡萄糖和蔗糖,也适用于糖尿病人等特殊人群。因此,果寡糖浆作为一种替代蔗糖的新一代甜味剂,具有非常好的应用前景。但是,现有的果寡糖浆的生产过程中,存在很多问题,比如:利用现有的酶催化产果聚糖的效率不高、果寡糖浆纯化除葡萄糖困难,等等。本研究综合运用新酶基因挖掘和异源表达、酶催化机制研究、分子改造、酶的固定化和偶联催化等技术手段,为解决果寡糖浆制备工艺中的关键技术难题奠定基础。首先,本文首次对丙酮丁醇梭菌的菌果聚糖合成酶(levansurase)CA-SacB进行了基因克隆、酶学性质分析与分子改造方面的研究。结果表明,该酶具有催化产物特异性好的特点,催化产物只有高聚合度的果聚糖和单糖,没有果寡糖的产生。经过测定该酶Km和Vmax值分别为64 mmol/L和190 umol/min/mg;对蔗糖底物的转化率高达60%,具有一定的工业生产应用价值。该酶是目前国内外首个从严格厌氧菌中克隆得到的菌果聚糖合成酶,与已经报道的菌果聚糖合成酶的同源性最高只有53%,对菌果聚糖合成酶的相关研究具有重要的参考价值。为了深入研究菌果聚糖合成酶的催化机制、蛋白空间结构和进化规律,挖掘新的菌果聚糖合成酶资源,本研究还通过宏基因组改组的方法对CA-SacB进行了分子改造,为相关领域的研究提供一个新方法和思路。第二,通过研究菌果聚糖合成酶的条件致死现象和分子定位,为揭示该酶的表达特征、催化机制和分子进化奠定基础。众所周知,表达解淀粉芽孢杆菌的菌果聚糖合成酶BA-SacB的大肠杆菌不能在含有蔗糖的培养基上生长,因此BA-SacB常作为一种负筛选标记,在分子生物学研究中被广泛应用。但是这种条件致死现象的机理一直不清楚。本研究通过对BA-SacB信号肽的删除和分子定位研究,在国内外首次证明了这一条件致死现象与BA-SacB的分泌表达和levan在周质空间的形成直接相关。此外,还通过定点突变和区段删除等方法对该酶进行了分子改造,通过分析突变前后的酶学性质,并结合生物信息学分析,为揭示该酶的催化机理及分子进化规律提供理论依据。第三,本研究对几种新的菌果聚糖水解酶(levanase)基因进行了克隆、异源表达和酶学特征分析。分别克隆到来源于解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的多个新的菌果聚糖水解酶,并分别对其酶学性质分析,催化产物成分分析和生物信息学分析。研究表明,来源于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的两种菌果聚糖水解酶BL-LEV和BS-LEV2属于外切酶,其催化产物中含有大量的果糖,但没有低聚糖的产生。这两种酶Km值分别为16 mmol/L和28 mmol/L菌果聚糖,最适反应温度分别为30℃和20℃,pH分别为8.0和7.0;而来源于解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的另外两种菌果聚糖水解酶BA-LEV和BS-LEV1则表现为内切酶活性,其催化产物中多为分子量在1200 Da的果寡糖,但没有果糖的产生。经过测定这两种酶Km值分别为69 mmol/L和82 mmol/L,最适反应温度在30-70℃之间。BA-LEV的pH范围较广,从3到7范围内活性都很高;而BS-LEV1的最适pH为5。良好的催化效率和不同的酶学特征决定了这几种菌果聚糖水解酶具有不同的应用价值。最后,本研究通过菌果聚糖合成酶和菌果聚糖水解酶双酶偶联催化,以蔗糖为底物产生高纯度果寡糖浆,从而为降低果寡糖浆生产成本,提高产率奠定坚实基础。本研究首先采用菌果聚糖合成酶催化蔗糖获得菌果聚糖、单糖和蔗糖的混合物,然后采用改进的工艺对菌果聚糖进行纯化,并采用菌果聚糖水解酶将菌果聚糖水解成果寡糖浆。这种双酶偶联催化法具有工艺简单,果寡糖浆纯度高(产物中果寡糖和菌果聚糖含量接近100%)的特点。更重要的是,可以避免传统方法分离剔除葡萄糖等副产物所需要的复杂工艺。另外,本研究还建立了新的纳米氧化锌固定化和细胞膜固定化体系,对菌果聚糖合成酶和菌果聚糖水解酶分别进行固定化处理,显著提升了各项酶学性质。在此基础上,对双酶偶联催化过程中的各种影响因素(包括反应温度、pH反应时间等)进行了响应面综合分析,确定其最佳条件为:在底物蔗糖浓度为200 g/L的条件下,确定产菌果聚糖最佳条件为:反应温度为45℃、反应时间7 h、溶液pH为7.0在这样的条件下催化产糖率为47.44%。在底物菌果聚糖浓度为105 g/L的条件下,确定产果寡糖浆最佳条件为:反应温度为42℃、反应时间7 h、溶液pH为7.0。在这样的条件下催化产糖率为88.28%。这一研究对果寡糖浆生产模式的改进具有重要意义,并且对相关领域的研究也具有重要的参考价值。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O636.1;Q55
【部分图文】：

Fig. 2-20 Protein sequence alignment（6）进化树取来源于不同菌的菌果聚糖合成酶的基因序列建立进化树，如图2-21所示，该酶与于Paraburkholderia phymatum的菌果聚糖合成酶亲缘关系较近，与来源于Bacillusbtilis的菌果聚糖合成酶亲缘关系较远。Fig. 2-21 Phylogenetic tree of CA-SacB
【参考文献】

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本文编号：2854702