NADH荧光探针的设计合成及分析应用

发布时间：2020-11-10 19:36

　　 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其氧化形式(NAD~+)在所有生命系统中都是普遍存在的,并且是超过300种氧化还原酶反应所必需的辅酶。在糖酵解、三羧酸循环及线粒体呼吸等能量代谢途径中参与了多数的氧化还原反应,在能量代谢和呼吸链电子传递过程中有着重要的作用。传统的检测方法是基于细胞内NADH的自发荧光进行检测及成像,这种方法灵敏度低,容易造成紫外照射损伤及无法避免细胞内其他物质的干扰。随后发展出电化学分析法、酶循环法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等方法。虽然这些方法能对NADH进行检测,但是这些检测方法只适用于体外NADH的检测,很难用于细胞及活体内NADH的含量及水平变化的分析。基于此,我们设计合成了两种可应用于细胞及活体内,高灵敏度、特异性检测NADH的荧光探针。该探针对研究NADH相关的生理、病理过程具有重要的意义。本论文综述了NADH的理化性质、生理功能以及常用的检测方法,并综述了基于荧光探针(基因编码探针、纳米探针、小分子探针)检测NADH的研究现状及发展趋势。论文主要包括以下工作:1、我们利用二氰基异氟尔酮作为发色团,喹啉鎓作为NADH还原位点设计并合成了一种检测NADH的近红外(NIR)荧光探针DCI-MQ。探针与NADH反应之后,由于存在较强分子内电荷转移(ICT),最大吸收波长红移至568 nm,并且在660 nm处发射较强的荧光。在模拟生理条件下(10 mM PBS,pH=7.4),我们测定了该探针对NADH的响应,在NADH浓度为0~1μM时,探针荧光强度的变化与NADH浓度之间呈现良好的线性关系:F=22.12+134.27[NADH],线性相关系数为0.9915,检测限为12 nM。此外,我们利用该探针成功实现了对HepG2肝癌细胞与荷瘤小鼠内NADH的检测及成像。2、为了进一步优化探针,提高检测的灵敏度、选择性,我们利用三氰基呋喃(TCF)合成了另外一种检测NADH的荧光探针TCF-MQ。探针与NADH反应后,发射波长红移至610 nm,并且荧光增强。在模拟生理条件下(10 mM PBS,pH=7.4),我们测定了该探针对NADH的响应,在NADH浓度为0~3μM时,探针荧光强度的变化与NADH浓度之间呈现良好的线性关系:F=83.22+238.42[NADH],线性相关系数为0.9819,检测限为6nM,提高了检测的灵敏度。
【学位单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O657.3
【部分图文】：

图 1-1 NAD+与 NADH 的结构式 1-2 所示，NAD+与 NADH 在 259nm 处均有最大吸收，但 NAD第二个吸收峰（吸光系数为 6.2 103M-1cm-1）。因此，NAD+通 NADH 时，340nm 处吸光度会变化，这也为测量许多酶的活外，NADH 在 340 nm 紫外光激发下，在 460 nm 处有最大发ADH 是有荧光的，而 NAD+没有荧光。根据这一性质，可以发荧光信号的变化来间接地反映细胞内代谢水平的变化。

图 1-1 NAD+与 NADH 的结构式 1-2 所示，NAD+与 NADH 在 259nm 处均有最大吸收，但 NAD第二个吸收峰（吸光系数为 6.2 103M-1cm-1）。因此，NAD+通 NADH 时，340nm 处吸光度会变化，这也为测量许多酶的活外，NADH 在 340 nm 紫外光激发下，在 460 nm 处有最大发ADH 是有荧光的，而 NAD+没有荧光。根据这一性质，可以发荧光信号的变化来间接地反映细胞内代谢水平的变化。

山东师范大学硕士学位论文头合成途径中，色氨酸或天冬氨酸在一系列酶的作用下，转换NaMN）[47]。NaMN 在烟酰胺单核苷酸腺苷酰基转移酶（Nmn烟酸腺嘌呤二核苷酸（NaAD），NaAD 的烟酸部分在 NAD 谷syn1）作用下转化为 NAD+[48]。救途径中，烟酰胺或烟酸在磷酸核糖转移酶的作用下分别生成NMN）或烟酸单核苷酸（NaMN）。在烟酰胺单核苷酸腺苷酰ATs）的作用下，NMN 转化为 NAD+，NaMN 转化为 NaAD，酰胺合成酶（Nadsyn1）作用下转化为 NAD+[48]。
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本文编号：2878272