赭曲霉毒素A核酸适配体的筛

发布时间：2020-11-13 09:47

　　 赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由各种曲霉属和青霉属等真菌产生的次生代谢产物,广泛存在于谷物和食品中,对人类和动物都有很大的危害。核酸适配体是通过指数富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)经体外筛选得到的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA),它们可通过自身形成特定复杂的空间三维结构以高亲和力和特异性结合靶标分子。本研究通过改良的氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)的SELEX筛选方法,获得OTA的核苷酸适配体,结合GO淬灭荧光和胶体金分光光度法技术,构建了两种基于适配体识别OTA的快速灵敏的检测方法。首先,基于GO吸附单链寡核苷酸ssDNA的原理,采用免固定化的GO-SELEX方法筛选OTA毒素适配体。经过10轮筛选获得适配体富集文库,经克隆测序后得到23条适配体候选序列,经一级、二级结构,亲和性和特异性分析,得到一条特异识别OTA毒素的最佳适配体Seq.14,其解离常数为138.9±4.9 nmol/L。其次,基于羧基荧光素(FAM)标记的适配体与GO之间的荧光共振能量转移(FRET)技术,构建了一种荧光传感器。当无OTA存在时,FAM标记的适配体被GO吸附并淬灭其荧光信号;当有OTA存在时,适配体与OTA结合,从GO上脱落,引起荧光的重新恢复。在最优条件下,OTA毒素浓度在20～3000nmol/L之间与荧光强度呈线性相关性(R2=0.995),检测限为21.8nmol/L,加标回收率范围在96.0～119.7%之间,相对标准偏差为3.8%。该方法可用于红酒样品中OTA毒素的检测。最后,基于核酸适配体对靶标的特异性和胶体金分光光度法的灵敏性,建立了一种简单快速检测OTA的方法。利用核酸适配体能够抑制胶体金在高盐溶液中的聚集,当OTA存在时,其与适配体特异性结合,使胶体金发生聚集,胶体金的颜色发生变化。在最优的条件下,吸光度的比值(A656nm/A520nm)与OTA浓度在0～300 ng/mL的范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=0.001x+0.2264,线性相关系数R2为0.9962,加标回收率为99.2～103.1%,相对标准偏差为4.4%。该方法稳定性和重复性较好,可作为OTA的快速检测方法。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q503;O657.3
【部分图文】：

天津科技大学硕士学位论文ＯＴＡ的特异性识别能力，杂交链反应模拟脱氧核酶技术开发了一种比色法检测ＯＴＡ。该方法的线性范围至?０．０１?ｎｍｏｌ／Ｌ。??的有效性已经被广泛证实，通过物质所具有的的特性质进行定性定量分析。Ｑｉａｎ等利用ＦＲＥＴ原则，设过荧光传感和肉眼观察双重模式检测ＯＴＡ。Ｌｖ等测双链ＤＮＡ这一特定性，建立了一种ＯＴＡ检测方法。其互补链配对形成双螺旋结构，通过ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ作为指部分适配体与ＯＴＡ结合，加入其互补链与ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＡ的适配体杂交形成双螺旋结构，ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ插入到双号。根据荧光信号与ＯＴＡ浓度的相关性，定量检测Ｏ检测范围超过５个数量级。??

Ａｐｔａｍｅｒ?Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ?Ａ?Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ??ｓｔｒａｎｄ??图１－２无标记焚光检测ＯＴＡ示意图??Ｆｉｇ．?１－２?Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ＯＴＡ??经典的电化学传感器是以电极表面作为一个固定化传感元件的平台，结合在其上??面的分析物通过对电流、电位或电阻变化的监控来进行检测。Ｌｉｎｇ等Ｈ｜］基于金纳米粒??子（ＡｕＮＰｓ）共价结合石墨烯片的电化学阻抗用于检测皮摩尔级ＯＴＡ，原理如图丨－３：金??纳米颗粒共价键合还原氧化石墨烯（ＡｕＮＰｓ－ｒＧＯ）在石墨烯片上产生了大量分散良好??的ＡｕＮＰ，其具有巨大的ＤＮＡ结合位点，因为单个ｒＧＯ片和每个ＡｕＮＰ可以装载数??百个ＤＮＡ链。制作了一个夹心模型的适体传感器，其中包含固定在金电极上的硫化??的捕获ＤＮＡ以捕获适配体，然后将传感界面与所需浓度的ＯＴＡ共同孵育，后将??ＡｕＮＰｓ－ｒＧＯ官能化的ＤＮＡ与残留的适配体杂交。通过信号放大平台，检测电荷转移??电阻（Ｒｃｔ）〇该方法检测限为０．３?ｐｇ／ｍＬ或０．７４?ｐｍｏｌ／Ｌ。Ｈｕａｎｇ等［４２］基于滚环扩增技术??（ＲＣＡ）来实现电化学信号扩大进而进行检测ＯＴＡ。其原理是：用于ＲＣＡ的引物由两??部分组成，一部分为ＯＴＡ的核酸适配体，而另一部分与电极表面上的捕获探针互补。??当ＯＴＡ存在时

能够被ＧＯ保护抵抗不受核酸酶降解，当ｓｓＤＮＡ脱离ＧＯ表面后，由于不再受到??ＧＯ的保护，能被核酸酶的降解。除此之外，ＧＯ同样能够对ＲＮＡ产生保护能力。基??于ＧＯ对核酸分子的保护效果，建立了?ＧＯ稳定ＲＮＡ的方法，其原理如图１－４所示，??并基于该方法发展了?ＲＮａｓｅ?Ｈ辅助的信号放大方法用于检测ＤＮＡ，检测限为０．１??ｐｍｏｌ／Ｌ〇??＊■?ｒ＼１Ｂ?＜３＾?ＩＳｕｒｌｅａｗ，?ｆ?＼／?＼?Ｔａｒｇｅｔ??图１－４?ＧＯ保护ＲＮＡ探针的原理??Ｆｉｇ．?１－４?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲＮＡ?ｐｒｏｂｅ?ｗｉｔｈ?ＧＯ??１．４．２纳米金粒子??纳米金（ｇｏｌｄ?ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＡｕＮＰｓ），是一种直径１￣１００?ｎｍ之间的金的微小颗粒。??在溶液中，金纳米粒子通过氯金酸（ＨＡｕＣＵ）由还原剂如柠檬酸三钠、抗坏血酸等还原??成金颗粒，形成由负电荷包裹的稳定、均匀、呈单一分散状态的金颗粒悬浮液，并在??静电条件下形成稳定的疏水胶体状态，故而又称之为胶体金（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ）。不同粒径??的胶体金溶液具有不同的光的散射作用，胶体金溶液会呈现不同的颜色，最小的胶体??金（２？５?ｎｍ）是橙色的
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本文编号：2882055