疏水性电荷诱导层析介质的吸附性能和作用机制研究

发布时间：2020-11-21 02:41

　　 抗体是重要的生物药物和免疫诊断试剂,具有巨大的市场需求。基于蛋白A亲和层析的传统抗体分离方法存在成本高昂、配基泄露、洗脱条件苛刻等局限,制约了抗体产业的发展。疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)作为一种新型抗体分离方法,具有吸附容量大、选择性较高、分离条件温和、成本较低等优点,具有良好的抗体分离应用潜力,但相关机理认识需要进一步加强。本文以商业化HCIC介质MEPHyperCel和三种新型HCIC介质(MMI、ABI和W-ABI介质)为主要研究对象,以静态吸附和等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)为主要研究手段,考察了四种HCIC介质的蛋白吸附性能,并从热力学角度揭示HCIC介质的作用机理,为分离过程优化和新型配基设计提供重要依据。首先,考察了 MEPHyperCel介质的蛋白吸附性能研究。MEPHyperCel介质对三种抗体(hIgG、bIgG和mAb)的吸附容量均远大于两种血清白蛋白(HSA和BSA),体现出抗体分离的应用潜力。MEPHyperCel吸附具有较强的pH依赖性和一定的耐盐吸附特性。添加辛酸钠能够明显降低MEPHyperCel对BSA的吸附量,提高对IgG的选择性。实验发现,同时加入辛酸钠和一定浓度的NaCl,能够显著减少MEPHyperCel介质对BSA的吸附。温度升高也会一定程度减少BSA的吸附。在吸附实验基础上,利用ITC对辛酸钠、MEP配基和MEP介质与蛋白相互作用进行了研究。发现辛酸钠-BSA间的相互作用大于辛酸钠-IgG,且辛酸钠-BSA相互作用以疏水作用为主。加入辛酸钠同时加入一定浓度NaCl,或者升高温度,会使辛酸钠与BSA间的疏水作用增强。同时,ITC结果表明,IgG与MEP配基之间的亲和力远高于白蛋白,且MEP-IgG间同时存在疏水作用、静电作用、氢键、范德华力等多种作用力。pH变化显著影响MEP与IgG之间的静电作用和疏水作用,导致MEP HyperCel介质对hIgG的吸附容量有较大的变化。此外,ITC结果揭示了 MEPHyperCel介质耐盐吸附特性的热力学机制,即MEP配基与hIgG相互作用的过程中存在熵焓补偿现象,使得反应自由能的变化不大。其次,考察了三种新型HCIC介质(MMI、ABI和W-ABI介质)的吸附性能研究。中性pH条件下,三种新型HCIC介质对hIgG均有较高的吸附容量,其中含有双功能配基的W-ABI介质对hIgG的吸附力最强,ABI介质次之,MMI介质最弱。三种介质同样体现出较明显的pH依赖性吸附特性和较好的耐盐吸附性能。相对而言,W-ABI介质的pH敏感性比另外两种介质弱。50%体积浓度的乙二醇可以较明显地降低MEP HyperCel、MMI和ABI介质的饱和吸附容量,但对W-ABI介质的吸附性能影响不大。1 M精氨酸浓度下,四种HCIC介质的吸附容量均有所减小,但整体变化幅度不大,说明精氨酸对这四种介质的蛋白解吸促进作用并不明显。最后,对新型HCIC介质-蛋白相互作用进行了 ITC研究。考察了不同pH、NaCl浓度、乙二醇浓度和精氨酸浓度下,MMI、ABI和W-ABI与hIgG之间的相互作用,并与MEP HyperCel介质进行对比。发现pH对介质-蛋白相互作用的影响显著,不同介质的NaCl影响略有不同,加入乙二醇会屏蔽介质-蛋白间的疏水作用,而精氨酸的加入则会屏蔽静电作用。中性pH条件下,MMI、ABI和W-ABI介质均通过混合作用模式实现抗体的结合。其中,MMI介质的亲硫作用和疏水作用较强,静电作用较弱;ABI介质与MEP HyperCel介质的作用机理相近,但疏水作用的贡献要大于MEP HyperCel介质;W-ABI介质与hIgG间的作用力比较强,导致W-ABI介质具有很好的耐盐吸附性能,但对pH的依赖性没有其它三种介质高。本文以了解HCIC介质的蛋白吸附性能和作用机理为出发点,探讨了 pH、盐和特殊添加剂对吸附性能的影响,通过ITC实验探讨了 HCIC介质与抗体之间的相互作用,揭示了 HCIC介质的作用机理,为层析分离的过程优化和新型配基的设计提供重要的依据。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：O647.3
【部分图文】：

Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ?Ｇ．??ＩｇＧ的分子量约为１５０ｋＤａ，由四个多肽链组成，两条重链（约５０ｋＤａ）和两条轻链??（约２５ｋＤａ）通过二硫鍵连接而形成Ｙ形结构［４１，４２］（如图１．１）。根据组成氨基酸的可变??性，重链和轻链可进一步分为恒定区（ｃｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎ，Ｃ区）和可变区（ｖａｒｉａｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，??Ｖ区）。可变区域可进一步细分为变异性高的氨基酸组成的高变区（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，??ＨＶ区）和相对保守的氨基酸序列组成的骨架区（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）。ＨＶ区可以表??面互补的方式结合抗原，因此也称为互补决定区（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ?ｒｅｇｉｏｎ，??２??

使得抗体结合于ＭＥＰ介质上［６４］。当调节溶液ｐＨ至４．８以下，配基上的氮原子被质子化，??使得配基带正电，与同样带正电荷的抗体发生静电排斥作用，实现洗脱。??ＭＥＰ介质与抗体分子之间的作用机制示意图如图１．３听示。??＾翁??ＭＥＰ?ｌｉｇａｎｄ?ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ?ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ??ａｎｄ?ｈｙｄｒｏｇｅｎ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ａｔ?ａｃｉｄｉｃ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ??ａｔ?ｎｅｕｔｒａｌ?ｐＨ??图１．３ＭＥＰＨｙｐｅｒＣｅｌ分离抗体的作用机制??Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＭＥＰ?ＨｙｐｅｒＣｅｌ?ｆｏｒ?ａｎｔｉｂｏｄｙ??１．３．２疏水性电荷诱导层析的功能配基??ＨＣＩＣ介质的配基一般是一些带有疏水性或芳香性的基团，如吡啶和咮唑等含氮杂环??基团，可以通过调节ｐＨ来改变其带电属性。表１．２中列出了一些近年来文献中报道的??ＨＣＩＣ功能配基。??１９９８年，Ｂｕｒｔｏｎ等［８］报道了?４－巯乙基吡啶、２－巯基－１－曱基咮唑、４－氨曱基吡啶、２－??氨乙基吡啶四种ＨＣＩＣ配基，并用于分离蛋白质。Ｂｕｒｔｏｎ等比较了氨基类、羧基类和硫??醇类这三类ＨＣＩＣ配基，发现硫醇类配基的偶联反应过程更筒单，更具有优势。Ｃｏｆｆｉｎｉｅｒ??８??

和熵变Ａ５等。ＩＴＣ可以用于测定吸附过程中热量变化，并且给出热力学参数信息，从而??了解蛋白与配基以及蛋白与介质之间的作用机理。??图１．４展示了英国马尔文仪器公司的三款ＭｉｃｒｏＣａ丨系列等温滴定量热仪，其中实验??室较为常用的是ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＶＰ－ＩＴＣ这一型号。??ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＰＥＡＱ－１ＴＣ?Ａｕｔｏｍａｔｅｄ?ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＰＥＡＱ－ＩＴＣ?ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＶＰ－ＩＴＣ??ｍ??ｒ：?．?；ｉ?，、．，１?】?Ｚ?｜??■?…ｙ??图１．４?ＭｉｃｒｏＣａｌ系列等温滴定量热仪??Ｆｉｇ．?１．４?ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＩＴＣ?ｆｒｏｍ?Ｍａｌｖｅｒｎ?Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ?Ｌｔｄ．??等温滴定量热仪的基本工作原理如图１．５所示［１２汍上半部分的注射器（ｓｔｉｒｒｉｎｇ?ｓｙｒｉｎｇｅ）??中装有待滴定的溶液，注射器同时具有滴定和搅拌的功能，可使反应更快地迗到平衡。??下半部分的绝热壳中有参比池（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｃｅｌｌ）和样品池（ｓａｍｐｌｅｃｅｌｌ），参比池中装满缓??冲液（或超纯水），样品池装入被滴定的溶液。滴定开始前，同时给两个池子加热，保证??温度相同
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本文编号：2892392