有机小分子荧光探针的合成及性能研究

发布时间：2017-04-07 08:20

  本文关键词：有机小分子荧光探针的合成及性能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。许多生命活动如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等依赖于这些包含巯基的硫醇类物质；细胞内pH值在生理及病理过程如受体介导的信号传导、酶活性、细胞生长和凋亡、离子运输和稳态调节、钙含量调节、细胞内吞作用、趋化作用、细胞粘附和肿瘤生长等过程中起到非常重要的作用；生物体自发产生的H2S气体被视为一种气体传递质，在一系列生理活动中起到诸多积极作用如血管舒张、抗氧化剂和镇静剂等；SO2是一种存在于空气中的有毒污染物，对人体许多器官是有害的，研究表明生物体心脏血管系统也会自发产生SO2，SO2能够作为一种气体传递质在调节血压及重塑血管过程中发挥重要作用。用荧光探针定量检测生物体系中硫醇浓度、pH值以及H2S、SO2的浓度在生物化学和临床医学中具有重要意义。 本论文工作大体分为六部分，具体内容如下： 1.探针1对于硫醇类化合物有快速的比色及比率型响应，其吸收及荧光谱峰分别有着长达143nm和109nm的蓝移。此探针还具有很好的灵敏度和选择性，且能够在很大的pH范围内检测硫醇。通过核磁共振氢谱和质谱分析的方法，我们解释了巯基对探针分子中活性双键亲核进攻的检测机理。运用这样一种水溶性探针对KB细胞进行荧光成像研究，在检测细胞内硫醇的实验过程中能够取得良好的比率型实验效果。 2.设计并合成了一种基于方酸荧光团和2,4-二硝基苯磺酰基（DNS）识别基团的硫醇荧光探针2。在乙腈-PBS缓冲溶液(1:9, v/v)中，此探针对硫醇类氨基酸有着荧光开启型的响应，对半胱氨酸（Cys）和高半胱氨酸（Hcy）荧光信号分别能够得到33和22倍的增强，发射出来的红色荧光处于近红外区域，且具有高灵敏度、高选择性和快速响应（20分钟内）等特点。荧光成像研究显示此探针细胞膜透过性很好，，能够顺利应用于细胞内硫醇类化合物的检测。 3.将香豆素荧光团与苯并噻唑或吲哚以双键相连接，合成了三种D-π-A结构的pH比率型荧光探针3-5。基于分子内电荷转移（ICT）机理，这三个探针分子在吸收和荧光光谱实验中均分别对H+有着比色和比率型双波段变化。含苯并噻唑基团的探针3和含吲哚基团的探针4、5在吸收和荧光光谱上对pH响应呈现出波长位移方向完全相反的性质。探针5是一个能够在近红外发射范围对pH响应的比率型荧光探针，酸性条件下其荧光谱峰有着长达122nm的红移。探针5具有响应迅速、优良的细胞膜透过性、高灵敏度、高选择性、良好的光稳定性和实时可逆等优点，被应用于细胞荧光成像实验中定量检测KB和HeLa细胞内pH值的变化。本项研究表明将香豆素荧光团与苯并噻唑或吲哚基团共轭相连而形成的具有ICT特性的分子结构是构建检测细胞内酸性微环境的近红外pH荧光探针的有效方法。 4.将间二乙氨基苯酚，原甲酸三甲酯和对甲苯磺酸吡啶嗡盐等原料采用一步法合成了罗丹明类衍生物6。探针6是一个很好的荧光开启型（OFF-ON）pH探针，在pH8.0至3.0变化范围内，荧光强度有约400倍的增强，pKa值经计算为4.73。探针6还具有高选择性、响应迅速、良好细胞膜透性、响应可逆性、光稳定性和不受环境温度变化影响等性能。这些特性使得该pH探针能够作为特异性检测溶酶体内pH值的红光发射的荧光探针应用于细胞内荧光成像。 5.基于苯并[a]吩VA嗪类染料合成了三个检测H2S的近红外探针分子7-9，其中在9-(二乙基氨基)苯并[a]吩VA嗪-5-酮（尼罗红）染料的3位引入2,4-二硝基苯醚基团合成的近红外荧光探针7对H2S有荧光开启型响应。探针7与5当量的H2S混合之后，荧光光谱上位于666nm处的荧光峰强度增强约18倍。通过核磁和质谱分析手段验证了探针7在与H2S反应之后生成了化合物8。发生的独特的醚键硫解反应使得探针7能够有效排除生物类硫醇物质对检测的干扰。细胞荧光成像实验表明探针7能够作为细胞内实时检测H2S的近红外荧光增强型探针，而探针8在检测细胞内H2S的过程中表现为近红外荧光减弱型探针。 6.基于VA嗪和Tk吨类染料我们设计合成了三个水溶性SO2荧光探针10-12。检测时由于SO32-或HSO3-对分子结构中活性位的亲核进攻，探针10和11表现为比色型和荧光增强型探针。而探针12在检测时由于发生加成反应使分子的π-共轭结构受到破坏，探针分子的荧光逐渐淬灭，相应的溶液颜色由粉红色逐渐变为无色。这三个探针分子具有检测速度快、生理pH范围响应、高选择性和灵敏度等优势，荧光成像研究表明这三个探针能够对细胞内SO2衍生物进行特异且有效的识别，且细胞膜透过性较好，毒性也相对较低。基于这种检测机理的荧光探针在该领域尚属首次报道。
【关键词】：荧光探针 硫醇 溶酶体 荧光成像 PET ICT
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 第一章 前言16-61
• 1.1 绪论16
• 1.2 荧光探针的结构及识别原理16-17
• 1.3 硫醇荧光探针研究进展17-40
• 1.3.1 利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇18-27
• 1.3.2 利用巯基对缺电子芳环的亲核取代反应(ArSN)检测硫醇27-30
• 1.3.3 利用巯基与二硫键的氧化还原反应检测硫醇30-33
• 1.3.4 利用与醛基的成环反应检测硫醇33-37
• 1.3.5 其它机理检测硫醇37-40
• 1.4 氢离子荧光探针研究进展40-59
• 1.4.1 萘酰亚胺类氢离子荧光探针41-44
• 1.4.2 荧光素和罗丹明类氢离子荧光探针44-48
• 1.4.3 氟化硼络合二吡咯甲川（BODIPY）类氢离子荧光探针48-51
• 1.4.4 花菁类氢离子荧光探针51-56
• 1.4.5 基于其它荧光团的氢离子荧光探针56-59
• 1.5 论文研究意义及主要内容59-61
• 第二章 基于 ICT 原理设计的VA嗪-苯并噻唑菁类反应型硫醇荧光探针61-76
• 2.1 引言61
• 2.2 探针分子的设计61-62
• 2.3 实验部分62-63
• 2.3.1 主要实验仪器62
• 2.3.2 主要试剂62-63
• 2.4 化合物的合成及结构表征63-64
• 2.4.1 目标化合物合成路线63
• 2.4.2 实验步骤及表征63-64
• 2.5 探针分子性能测试64-66
• 2.5.1 探针母液的配制和使用64
• 2.5.2 pH 对探针荧光光谱的影响64-65
• 2.5.3 摩尔消光系数的测定65
• 2.5.4 荧光量子产率的测定65
• 2.5.5 Job's 曲线的测定65
• 2.5.6 细胞培养与荧光成像实验65-66
• 2.6 实验结果与讨论66-74
• 2.6.1 含巯基小分子化合物对探针 1 吸收光谱和荧光光谱的影响66-68
• 2.6.2 探针 1 的选择性测试68-70
• 2.6.3 pH 及检测时间对探针 1 性能的影响70-72
• 2.6.4 探针 1 识别机理的研究72-73
• 2.6.5 探针 1 检测细胞内硫醇类物质的荧光成像实验73-74
• 2.7 本章小结74-76
• 第三章 基于 PET 原理设计的方酸类近红外荧光开启型硫醇探针76-93
• 3.1 引言76-77
• 3.2 探针分子的设计77
• 3.3 实验部分77-78
• 3.3.1 主要实验仪器77
• 3.3.2 主要试剂77-78
• 3.4 化合物的合成及结构表征78-80
• 3.4.1 目标化合物合成路线78
• 3.4.2 合成步骤及表征78-80
• 3.5 探针分子性能测试80-82
• 3.5.1 探针母液的配制和使用80
• 3.5.2 动力学测试80-81
• 3.5.3 pH 对荧光光谱的影响81
• 3.5.4 摩尔消光系数的测定81
• 3.5.5 荧光量子产率的测定81
• 3.5.6 细胞培养与荧光成像实验81-82
• 3.6 实验结果与讨论82-92
• 3.6.1 巯基类氨基酸对探针 2 吸收光谱和荧光光谱的影响82-85
• 3.6.2 探针 2 对含巯基氨基酸的选择性实验85-86
• 3.6.3 探针 2 对含巯基氨基酸的响应时间研究86-87
• 3.6.4 pH 对探针 2 性能的影响87-88
• 3.6.5 探针 2 对巯基类氨基酸检测机理的研究88-91
• 3.6.6 探针 2 的细胞内荧光成像91-92
• 3.7 本章小结92-93
• 第四章 基于 ICT 原理设计的香豆素-吲哚类近红外氢离子荧光探针93-114
• 4.1 引言93
• 4.2 探针分子设计93-94
• 4.3 实验部分94-95
• 4.3.1 主要实验仪器94
• 4.3.2 主要试剂94-95
• 4.4 化合物的合成及结构表征95-97
• 4.4.1 目标化合物合成路线95
• 4.4.2 合成步骤及表征95-97
• 4.5 探针分子性能测试97-99
• 4.5.1 探针母液的配制和使用97
• 4.5.2 其它干扰物对探针 5 吸收和荧光光谱的影响97-98
• 4.5.3 摩尔消光系数的测定98
• 4.5.4 荧光量子产率的测定98
• 4.5.5 细胞培养和荧光成像实验98-99
• 4.6 实验结果与讨论99-112
• 4.6.1 pH 对探针吸收光谱和荧光光谱的影响99-104
• 4.6.2 探针 5 对氢离子的选择性研究104-105
• 4.6.3 探针 5 的细胞荧光成像105-111
• 4.6.4 激发光谱、回复性、光稳定性以及识别机理的研究111-112
• 4.7 本章小结112-114
• 第五章 基于 PET 原理设计的罗丹明类氢离子荧光探针114-126
• 5.1 引言114
• 5.2 探针分子的设计114-115
• 5.3 实验部分115-116
• 5.3.1 主要实验仪器115
• 5.3.2 主要试剂115-116
• 5.4 化合物的合成及结构表征116-117
• 5.4.1 目标化合物合成路线116
• 5.4.2 实验步骤及表征116-117
• 5.5 探针分子性能测试117-119
• 5.5.1 探针的标准 pH 滴定测试117
• 5.5.2 选择性和竞争性实验117-118
• 5.5.3 摩尔消光系数的测定118
• 5.5.4 荧光量子产率的测定118
• 5.5.5 细胞培养和荧光成像实验118-119
• 5.6 实验结果与讨论119-125
• 5.6.1 pH 对探针 6 的吸收光谱和荧光光谱的影响119-120
• 5.6.2 探针 6 的选择性和竞争性测试120-121
• 5.6.3 探针 6 对 H+识别的机理研究121
• 5.6.4 激发光谱、回复性、光稳定性以及温度影响的研究121-123
• 5.6.5 探针 6 的细胞内荧光成像123-125
• 5.7 本章小结125-126
• 第六章 基于 PET 原理设计的VA嗪类近红外 H2S 荧光探针126-148
• 6.1 引言126
• 6.2 探针分子的设计126-127
• 6.3 实验部分127-128
• 6.3.1 主要实验仪器127
• 6.3.2 主要试剂127-128
• 6.4 化合物的合成及结构表征128-131
• 6.4.1 目标化合物合成路线128
• 6.4.2 实验步骤及表征128-131
• 6.5 探针分子性能测试131-132
• 6.5.1 探针母液的配制和使用131
• 6.5.2 pH 对探针荧光光谱的影响131
• 6.5.3 摩尔消光系数的测定131
• 6.5.4 荧光量子产率的测定131-132
• 6.5.5 探针与 H2S 反应动力学测试132
• 6.5.6 细胞培养与荧光成像实验132
• 6.6 实验结果与讨论132-146
• 6.6.1 H2S 对探针吸收光谱和荧光光谱的影响132-139
• 6.6.2 探针 7 的选择性和检测限测试139-141
• 6.6.3 pH 及检测时间对探针 7 性能的影响141-143
• 6.6.4 探针 7 识别机理的研究143-145
• 6.6.5 探针 7 和 8 的细胞荧光成像研究145-146
• 6.7 本章小结146-148
• 第七章 VA嗪和Tk吨类水溶性 SO2荧光探针148-175
• 7.1 引言148-149
• 7.2 探针分子的设计149
• 7.3 实验部分149-151
• 7.3.1 主要实验仪器149-150
• 7.3.2 主要试剂150-151
• 7.4 化合物的合成及结构表征151-153
• 7.4.1 目标化合物合成路线151
• 7.4.2 实验步骤及表征151-153
• 7.5 探针分子性能测试153-154
• 7.5.1 探针母液的配制和使用153
• 7.5.2 pH 对探针荧光光谱的影响153
• 7.5.3 摩尔消光系数的测定153
• 7.5.4 荧光量子产率的测定153-154
• 7.5.5 细胞培养与荧光成像实验154
• 7.6 实验结果与讨论154-173
• 7.6.1 亚硫酸根离子对探针吸收光谱和荧光光谱的影响154-162
• 7.6.2 探针的选择性测试162-165
• 7.6.3 pH 对探针性能的影响165-167
• 7.6.4 探针识别机理的研究167-170
• 7.6.5 探针的细胞荧光成像170-173
• 7.7 本章小结173-175
• 第八章 结论与展望175-179
• 8.1 全文结论175-176
• 8.2 展望176-179
• 参考文献179-187
• 硕士期间发表的论文187-188
• 附图188-206
• 致谢206-207

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