细胞中化学修饰蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究
发布时间：2021-03-20 10:49
细胞是生命的基本单位,也是生物大分子发挥生物功能的主要场所。细胞的环境极其复杂,它内部的体积排阻和化学弱相互作用时刻影响着生物大分子的状态变化和功能发挥。细胞内核磁共振（In-cellNMR）可以在活细胞内获得原子水平分辨的生物大分子结构动态信息,帮助人们了解细胞环境对于生物大分子结构和功能的影响。本文主要运用In-cell NMR方法,使用19F作为生物大分子的原子探针,对细胞内的蛋白质化学修饰、蛋白质相互作用以及核酸G-四链体稳定性及相互作用展开研究,具体内容如下:In-cell NMR方法研究细胞内α-突触核蛋白的磷酸化修饰及其降解蛋白质在细胞内会发生广泛的化学修饰,磷酸化是其中一种十分常见且重要的修饰类型。现阶段,在活细胞内对蛋白质磷酸化进行直接、实时的观测仍然存在困难。本文通过In-cell NMR方法实现了细胞内蛋白质磷酸化的实时监测,并开展磷酸化修饰对蛋白质稳定性影响的研究。通过选用帕金森症相关的129位磷酸化α-突触核蛋白作为研究模型,对其在细胞内的去磷酸化过程进行跟踪研究,发现该蛋白质在细胞内会快速去磷酸化,并且129位磷酸化修饰会加快α-突触核蛋白质降解。本文的研究...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)湖北省
【文章页数】：164 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１细胞内复杂的环境１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ?ｉｎ?ｃｅｌｌ??
细胞中化学修饰蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究??（Ａ）?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??Ｖ－＾＾＝＝＝＝＝＾??（Ｄ）?Ｍｉｃｒｏｉｒ＾ｅｃｈｏｎ?（￡）?ＣＰＰ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??ＣＥＤ：Ｂ（＾ｄ?＾?＾??和：，＿适??Ｖ?ｙ?（Ｆ）?ｐ〇ｒｅ－＇〇＾ｉｎｇｔｏｘ，ｎｓ?（Ｑ）?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ??图１．２不同的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ方法示意图１１５１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｖｅｒｖｉｅｗ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ?ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．??将特定蛋白质表达质粒（红色）转染进入细菌（Ａ）、酵母（Ｂ）、昆虫或哺乳动物细胞??系（Ｃ）中，通过质粒过表达方法对目标蛋白质进行标记表达，实现在细胞内富集特定蛋白??质（绿色）。将同位素标记的特定生物大分子（蓝色），通过显微注射（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）的方??法富集到非洲爪蟾卵母细胞（Ｄ），通过细胞穿梭肽（Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰ．Ｅ）、穿孔??毒素（Ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇｔｏｘｉｎｓ，Ｆ）、电穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，?Ｇ）方法富集到哺乳动物细胞。??１．２．２真核细胞丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ??尽管基于原核大肠杆菌的丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ得到了很好的发展，但真核细胞结构??更加复杂，也发生着更为高级的生化过程，因此真核细胞内的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ显得??更为重要。除了原核大肠杆菌可以进行质粒过表达外，真核细胞也可以通过这种??方法来实现丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ样品的制备，且原理和操作方法类似。酵母最
矢量Ｍ，且方向与Ｂ。相同。当激发线圈发射的射频脉冲频率与原子核拉莫尔频??率（〇相同时，脉冲会使宏观磁矢量Ｍ绕着脉冲的方向进行章动，同时绕着Ｂ〇的??方向进动。脉冲停止后，宏观磁矢量Ｍ会回到Ｂ〇方向，并且释放能量，产生随??时间自由感应衰减（Ｆｒｅｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｄｅｃａｙ，?ＦＩＤ）的电流信号。经过离散傅里叶变??换（Ｆｏｕｒｉｅｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＦＴ?），可以将时域ＨＤ信号转化为频域ＮＭＲ信号，即ＮＭＲ??谱图。理想条件下，原子核的拉摩尔频率ｃｏ就是ＮＭＲ信号的频率（图１．３）。??／｛?／Ｃ〇Ｎ??ｆ?Ｉ??＾?Ｉ?＼?ＮＭＲ?Ｓｉｇｎａｌ??ｘ?Ｎｕｃｌｅａｒ?＇?Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ?ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ??图１．３原子核的磁共振信号检测??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔ?ｏｆ?ｎｕｌｃｅａｒ?ｍａｇｎｅｔｉｃ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ??在外磁场（Ｂ０）中，激发线圈发射射频脉冲对原子核的宏观磁矢量进行操纵，之后接收??线圈接收原子核释放能量而产生的自由感应衰减（ＦＩＤ）信号，最后经过离散傅里叶变换（ＦＴ）??转化为频域ＮＭＲ信号。??６??
【参考文献】：
期刊论文
[1]19F NMR技术在蛋白质研究中的应用[J]. 王桂芳,张则婷,徐国华,刘晓黎,吴琼,白佳,叶炎生,李从刚,刘买利. 波谱学杂志. 2012(04)
博士论文
[1]复杂环境下蛋白质结构、功能与稳定性的NMR研究[D]. 成凯.中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所) 2017
[2]核酸适配体分子识别机制及复杂环境下G-四链体的构象研究[D]. 赵嘉静.中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所) 2017
[3]细胞内蛋白质的19F核磁共振方法与应用研究[D]. 叶炎生.中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所) 2015
本文编号：3090876
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)湖北省
【文章页数】：164 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１细胞内复杂的环境１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ?ｉｎ?ｃｅｌｌ??
细胞中化学修饰蛋白及生物大分子相互作用的核磁共振研究??（Ａ）?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??Ｖ－＾＾＝＝＝＝＝＾??（Ｄ）?Ｍｉｃｒｏｉｒ＾ｅｃｈｏｎ?（￡）?ＣＰＰ?ｄｅｌｉｖｅｒｙ??ＣＥＤ：Ｂ（＾ｄ?＾?＾??和：，＿适??Ｖ?ｙ?（Ｆ）?ｐ〇ｒｅ－＇〇＾ｉｎｇｔｏｘ，ｎｓ?（Ｑ）?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ??图１．２不同的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ方法示意图１１５１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｖｅｒｖｉｅｗ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ?ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．??将特定蛋白质表达质粒（红色）转染进入细菌（Ａ）、酵母（Ｂ）、昆虫或哺乳动物细胞??系（Ｃ）中，通过质粒过表达方法对目标蛋白质进行标记表达，实现在细胞内富集特定蛋白??质（绿色）。将同位素标记的特定生物大分子（蓝色），通过显微注射（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）的方??法富集到非洲爪蟾卵母细胞（Ｄ），通过细胞穿梭肽（Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰ．Ｅ）、穿孔??毒素（Ｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇｔｏｘｉｎｓ，Ｆ）、电穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，?Ｇ）方法富集到哺乳动物细胞。??１．２．２真核细胞丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ??尽管基于原核大肠杆菌的丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ得到了很好的发展，但真核细胞结构??更加复杂，也发生着更为高级的生化过程，因此真核细胞内的Ｉｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ显得??更为重要。除了原核大肠杆菌可以进行质粒过表达外，真核细胞也可以通过这种??方法来实现丨ｎ－ｃｅｌｌ?ＮＭＲ样品的制备，且原理和操作方法类似。酵母最
矢量Ｍ，且方向与Ｂ。相同。当激发线圈发射的射频脉冲频率与原子核拉莫尔频??率（〇相同时，脉冲会使宏观磁矢量Ｍ绕着脉冲的方向进行章动，同时绕着Ｂ〇的??方向进动。脉冲停止后，宏观磁矢量Ｍ会回到Ｂ〇方向，并且释放能量，产生随??时间自由感应衰减（Ｆｒｅｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｄｅｃａｙ，?ＦＩＤ）的电流信号。经过离散傅里叶变??换（Ｆｏｕｒｉｅｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＦＴ?），可以将时域ＨＤ信号转化为频域ＮＭＲ信号，即ＮＭＲ??谱图。理想条件下，原子核的拉摩尔频率ｃｏ就是ＮＭＲ信号的频率（图１．３）。??／｛?／Ｃ〇Ｎ??ｆ?Ｉ??＾?Ｉ?＼?ＮＭＲ?Ｓｉｇｎａｌ??ｘ?Ｎｕｃｌｅａｒ?＇?Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ?ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ??图１．３原子核的磁共振信号检测??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｄｅｔｅｃｔ?ｏｆ?ｎｕｌｃｅａｒ?ｍａｇｎｅｔｉｃ?ｒｅｓｏｎａｎｃｅ??在外磁场（Ｂ０）中，激发线圈发射射频脉冲对原子核的宏观磁矢量进行操纵，之后接收??线圈接收原子核释放能量而产生的自由感应衰减（ＦＩＤ）信号，最后经过离散傅里叶变换（ＦＴ）??转化为频域ＮＭＲ信号。??６??
【参考文献】：
期刊论文
[1]19F NMR技术在蛋白质研究中的应用[J]. 王桂芳,张则婷,徐国华,刘晓黎,吴琼,白佳,叶炎生,李从刚,刘买利. 波谱学杂志. 2012(04)
博士论文
[1]复杂环境下蛋白质结构、功能与稳定性的NMR研究[D]. 成凯.中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所) 2017
[2]核酸适配体分子识别机制及复杂环境下G-四链体的构象研究[D]. 赵嘉静.中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所) 2017
[3]细胞内蛋白质的19F核磁共振方法与应用研究[D]. 叶炎生.中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所) 2015
本文编号：3090876
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