基于荧光相关光谱技术的单细胞PTEN蛋白动力学及p53-MDM2相互作用的研究

发布时间：2021-07-01 11:40

　　蛋白质作为承载生物功能的重要载体,在生命活动中发挥着极其关键的作用。蛋白质组学的研究发现并揭示了很多重要蛋白的生理功能与调控机制,极大地促进了我们对生命活动机制的理解。目前大多数关于蛋白质的研究是基于传统的生化方法,这些方法主要在溶液体系中进行,溶液体系简单可控,给研究带来了种种便利。然而,细胞作为组成生命体的最小单元,其复杂性远超出了人们的想象,因此在溶液中得到的研究结果不一定能够真实地反映蛋白在细胞内的存在状态。此外,绝大多数细胞外溶液体系的研究结果是建立在对细胞群体研究的基础上,忽略了细胞个体间的异质性（Cellular Heterogeneity）。这必然会导致生物信息的稀释或丢失,甚至会得出矛盾的结论。荧光相关光谱（FCS）及其相关技术是近年来发展的单分子检测方法,其具有灵敏度高,空间分辨率高,非侵入性检测等优点。这使得FCS及其相关技术非常适合在活细胞内进行蛋白浓度、扩散行为、寡聚化和相互作用等研究。同时荧光相关光谱适合在单个活细胞水平甚至是在亚细胞结构水平进行测定。本论文以荧光蛋白作为探针标记目标蛋白分子,同时构建了能够实现在线细胞培养、高分辨率成像以及活细胞原位荧光相关... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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FCS系统示意图

0图 1-2 FCCS 系统示意图Figure 1-2 Schematic diagram of FCCS setup2 FCCS 系统的结构典型的共聚焦 FCCS 系统如图 1-2 所示，由两路激光器发出的两束不同波长激元件进行空间光合束或者是光纤耦合合束后，通过扩束镜扩束，然后被二色镜镜，两束激光聚焦于样品中的同一位置，激发样品聚焦体积内的两种荧光粒子两种不同波长的荧光信号。物镜一般选择高数值孔径的水浸物镜，在样品中形小的检测微区，通常小于 1 fL。由于两种荧光粒子在溶液中作布朗运动进出检造成微区内两种荧光信号的涨落。由样品产生的荧光信号被同一物镜收集，透

图 2-1 FCS 装置示意图Figure 2-1 The setup of a FCS system.2.3.13 FCS 在活细胞中的测定方法在 FCS 测定前，首先在 488 nm 激光激发下使用压电陶瓷扫描装置对细胞进行方向扫描。带有 x-y 坐标信息的荧光光强信号被 FCS 系统收集，通过自行编写的 M程序将这个光强信号转换为高分辨率的细胞扫描成像图。该图具有 x-y 坐标位置信能够通过控制扫描装置，将镜头移动到特定的位置收集 FCS 信号。FCS 通常连续测定 5 次，每次 10s。因为在每次测定的过程中会由于光漂白造光分子数逐渐减少，所以我们取 5 次测定中的第一次数据进行浓度计算。对于扩散的计算，我们选择后四次的测定数据，因为在第一次测定时会将那些不太运动的荧子漂白。测定得到的 FCS 数据通过 Microcal Origin 8.0 软件进行非线性拟合。通过


本文编号：3259068