R-2-卤代酸脱卤酶DehDIV-R和脂肪酶PaL的结构与功能研究
发布时间：2021-08-01 14:28
X射线衍射晶体学是解析生物大分子结构的重要技术手段之一,广泛用于酶的三维结构解析。通过解析酶以及酶/小分子复合物的晶体结构,结合分子动力学的研究,可以获取酶与小分子的相互作用机制,并在分子水平上探究酶结构与功能的关系,为进一步对酶的理性改造提供结构依据。DehDIV-R是本实验室发现的R-2-卤代酸脱卤酶,产自假单胞菌ZJU6,能专一性地水解R-2-氯丙酸,具有重要的应用前景。目前关于R-2-卤代酸脱卤酶的晶体结构报道较少,对于其底物立体选择性研究也仅仅在R,S-2-卤代酸脱卤酶的结构基础上间接进行解释。本文通过多步层析法制备得到高纯度的DehDIV-R蛋白,采用悬滴气相扩撒法,在0.1 mol/HEPES（pH 7）,12%PEG 6000,0.2 mol/l MgC12,8mmol/LCHAPS条件下获得高质量晶体,并在上海同步辐射光源收集到一套分辨率为2.35 A的数据,采用CCP4 online服务器分子置换法解析得到DehDIV-及的晶体结构。基于结构分析的结果显示,DehDIV-R是由多个α螺旋组成的假二聚体结构,且活性中心Asp205与Asn131形成氢键,有利于Asp2...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２冷冻电镜技术分辨率的发展??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｔｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??
作用的一种膜蛋白ＴＲＰＶ１的结构从而使得冷冻电镜技术在蛋白质（尤其是??膜蛋白）的结构解析上得到重视，并标志着冷冻电镜正式进入“原子分辨率”时代，??见图１．２。２０１７年诺贝尔化学奖授予了在用冷冻电镜解析溶液中生物大分子高分??辨率结构方法学方面做出贡献的Ｊａｃｑｕｅｓ?Ｄｕｂｏｃｈｅｔ、Ｊｏａｃｈｉｍ?Ｆｒａｎｋ和Ｒｉｃｈａｒｄ??Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ?〇??ｂｅｆｏｒｅ?２０１３??图１．２冷冻电镜技术分辨率的发展??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｔｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??Ｘ射线衍射晶体法，用波长与原子间距离相近的Ｘ射线照射单晶，从而形??成衍射图谱。利用计算机辅助分析衍射点的强度、位置和图案等信息，并从中推??断出各个原子的位置信息，最终解析得到晶体结构，见图１．３。１８９５年Ｒｏｎｔｇｅｎ??发现了?Ｘ射线。１９１３年Ｂｒａｇｇ父子提出了晶体衍射理论以及著名的Ｂｒａｇｇ方程??（２ｄｓｉｎｅ＝ｒａ），奠定了理论基础。１９５３年Ｗａｓｔｏｎ和Ｃｒｉｃｋ基于ＤＮＡ的Ｘ射线衍??射图，推断出ＤＮＡ的双螺旋结构。１９５７年和１９５９年Ｋｅｎｄｒｅｗ和Ｐｅｒｕｔｚ分别通??过Ｘ射线衍射晶体法解析得到肌红蛋白和血红蛋白的结构。Ｘ射线衍射晶体法??由于分辨率高，是蛋白结构解析的重要手段，但高衍射质量的蛋白晶体的制备始??终是其发展的瓶颈之一。??ｒ……二二二？?．．．?Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ??■Ｓ＿＇＇?
Ｘ射线衍射晶体法用于解析蛋白结构的常规流程包括：蛋白的表达与纯化、??蛋白单晶的培养、Ｘ射线衍射数据的收集与处理、相角的获得、初始结构的搭建??与精修，见图１．４。其中主要难点在于蛋白单晶以及相角的获得。??ｃｒｙｓｔａｌ??Ｍ?１??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎａ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｉ?ｔｈｅ?＾?ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ??ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐａｔｔｅｒｎ??＼?Ｉ??Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ??■Ｉ?ｈ｜＿§?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｆｉｔｔｉｎｇ?■??ｉ?ＪｌＡ?辦?ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ??ａ＾ｅ??Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ??图１．４Ｘ射线衍射晶体法解析流程??Ｆｉｇ．?１．４?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?Ｘ－ｒａｙ?ｃｎ?ｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ??（ｉ）蛋白结晶??蛋白结晶是溶液中过饱和度的推动使得无序排列的蛋白以一定规律堆积而??形成有序集合体的过程［９］。蛋白晶体内部除了蛋白质分子外还有４０％？６０％的溶??剂，从而导致蛋白晶体易碎且容易出现不规则排列。蛋白结晶是一个多因素控制??的过程，可分为物理因素、化学因素以及生物因素三大类【１Ｑ］，目前还无法直接预??测蛋白结晶的生长条件，见表１．１。??批量结晶法、气相扩散法和透析法等是目前常用的蛋白结晶方法，且研究较??透彻，发展较成熟。批量法是将蛋白与结晶试剂在密闭环境中直接混合出预期的??过饱和度从而实现结晶。该方法操作简单，但需要的目标蛋白量较大，适用于工??业化的结晶［１１１。而气相扩散法常用于实验室微量结晶条件的筛选
【参考文献】：
期刊论文
[1]酶的理性设计[J]. 陈勇,王淑珍,陈依军. 药物生物技术. 2011(06)
[2]光学纯2-氯丙酸的拆分研究[J]. 张宝华,史兰香. 河北师范大学学报(自然科学版). 2010(06)
[3]左旋薄荷醇的合成现状及进展[J]. 陈旭敏,黄山,陆涛,赵小龙,姜标. 有机化学. 2009(06)
[4]生物催化与生物转化研究进展[J]. 欧阳立明,许建和. 生物加工过程. 2008(03)
[5]生物催化制备手性化合物技术进展[J]. 孙志浩. 精细与专用化学品. 2006(24)
[6]2-氯丙酸脱卤酶产酶菌种的筛选及酶学性质研究[J]. 项炯华,吴坚平,王能强,杨立荣. 化学反应工程与工艺. 2005(06)
[7]生物催化与生物转化的研究进展[J]. 卢定强,韦萍,周华,贾红华,欧阳平凯. 化工进展. 2004(06)
[8]低温X射线晶体衍射法在生物大分子结构分析中的应用[J]. 董襄朝. 结构化学. 2001(04)
[9]结构生物学的新进展[J]. 张景强,卢炘英,张勤奋. 物理. 2001(07)
[10]结构生物学的时代己经开始[J]. 邹承鲁. 科技导报. 1995(04)
博士论文
[1]C2/C3卤代酸脱卤酶的筛选及克隆表达[D]. 林春娇.浙江大学 2011
硕士论文
[1]脂肪酶PaL和脱卤酶DehDIV-R的结构解析[D]. 沈丹丹.浙江大学 2016
本文编号：3315696
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２冷冻电镜技术分辨率的发展??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｔｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??
作用的一种膜蛋白ＴＲＰＶ１的结构从而使得冷冻电镜技术在蛋白质（尤其是??膜蛋白）的结构解析上得到重视，并标志着冷冻电镜正式进入“原子分辨率”时代，??见图１．２。２０１７年诺贝尔化学奖授予了在用冷冻电镜解析溶液中生物大分子高分??辨率结构方法学方面做出贡献的Ｊａｃｑｕｅｓ?Ｄｕｂｏｃｈｅｔ、Ｊｏａｃｈｉｍ?Ｆｒａｎｋ和Ｒｉｃｈａｒｄ??Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ?〇??ｂｅｆｏｒｅ?２０１３??图１．２冷冻电镜技术分辨率的发展??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｔｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??Ｘ射线衍射晶体法，用波长与原子间距离相近的Ｘ射线照射单晶，从而形??成衍射图谱。利用计算机辅助分析衍射点的强度、位置和图案等信息，并从中推??断出各个原子的位置信息，最终解析得到晶体结构，见图１．３。１８９５年Ｒｏｎｔｇｅｎ??发现了?Ｘ射线。１９１３年Ｂｒａｇｇ父子提出了晶体衍射理论以及著名的Ｂｒａｇｇ方程??（２ｄｓｉｎｅ＝ｒａ），奠定了理论基础。１９５３年Ｗａｓｔｏｎ和Ｃｒｉｃｋ基于ＤＮＡ的Ｘ射线衍??射图，推断出ＤＮＡ的双螺旋结构。１９５７年和１９５９年Ｋｅｎｄｒｅｗ和Ｐｅｒｕｔｚ分别通??过Ｘ射线衍射晶体法解析得到肌红蛋白和血红蛋白的结构。Ｘ射线衍射晶体法??由于分辨率高，是蛋白结构解析的重要手段，但高衍射质量的蛋白晶体的制备始??终是其发展的瓶颈之一。??ｒ……二二二？?．．．?Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ??■Ｓ＿＇＇?
Ｘ射线衍射晶体法用于解析蛋白结构的常规流程包括：蛋白的表达与纯化、??蛋白单晶的培养、Ｘ射线衍射数据的收集与处理、相角的获得、初始结构的搭建??与精修，见图１．４。其中主要难点在于蛋白单晶以及相角的获得。??ｃｒｙｓｔａｌ??Ｍ?１??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎａ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｉ?ｔｈｅ?＾?ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ??ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐａｔｔｅｒｎ??＼?Ｉ??Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ??■Ｉ?ｈ｜＿§?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｆｉｔｔｉｎｇ?■??ｉ?ＪｌＡ?辦?ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ??ａ＾ｅ??Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ??图１．４Ｘ射线衍射晶体法解析流程??Ｆｉｇ．?１．４?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?Ｘ－ｒａｙ?ｃｎ?ｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ??（ｉ）蛋白结晶??蛋白结晶是溶液中过饱和度的推动使得无序排列的蛋白以一定规律堆积而??形成有序集合体的过程［９］。蛋白晶体内部除了蛋白质分子外还有４０％？６０％的溶??剂，从而导致蛋白晶体易碎且容易出现不规则排列。蛋白结晶是一个多因素控制??的过程，可分为物理因素、化学因素以及生物因素三大类【１Ｑ］，目前还无法直接预??测蛋白结晶的生长条件，见表１．１。??批量结晶法、气相扩散法和透析法等是目前常用的蛋白结晶方法，且研究较??透彻，发展较成熟。批量法是将蛋白与结晶试剂在密闭环境中直接混合出预期的??过饱和度从而实现结晶。该方法操作简单，但需要的目标蛋白量较大，适用于工??业化的结晶［１１１。而气相扩散法常用于实验室微量结晶条件的筛选
【参考文献】：
期刊论文
[1]酶的理性设计[J]. 陈勇,王淑珍,陈依军. 药物生物技术. 2011(06)
[2]光学纯2-氯丙酸的拆分研究[J]. 张宝华,史兰香. 河北师范大学学报(自然科学版). 2010(06)
[3]左旋薄荷醇的合成现状及进展[J]. 陈旭敏,黄山,陆涛,赵小龙,姜标. 有机化学. 2009(06)
[4]生物催化与生物转化研究进展[J]. 欧阳立明,许建和. 生物加工过程. 2008(03)
[5]生物催化制备手性化合物技术进展[J]. 孙志浩. 精细与专用化学品. 2006(24)
[6]2-氯丙酸脱卤酶产酶菌种的筛选及酶学性质研究[J]. 项炯华,吴坚平,王能强,杨立荣. 化学反应工程与工艺. 2005(06)
[7]生物催化与生物转化的研究进展[J]. 卢定强,韦萍,周华,贾红华,欧阳平凯. 化工进展. 2004(06)
[8]低温X射线晶体衍射法在生物大分子结构分析中的应用[J]. 董襄朝. 结构化学. 2001(04)
[9]结构生物学的新进展[J]. 张景强,卢炘英,张勤奋. 物理. 2001(07)
[10]结构生物学的时代己经开始[J]. 邹承鲁. 科技导报. 1995(04)
博士论文
[1]C2/C3卤代酸脱卤酶的筛选及克隆表达[D]. 林春娇.浙江大学 2011
硕士论文
[1]脂肪酶PaL和脱卤酶DehDIV-R的结构解析[D]. 沈丹丹.浙江大学 2016
本文编号：3315696
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