Na_2SeO_3诱导肿瘤细胞凋亡过程中硒醇和活性氧的检测

发布时间：2017-04-29 13:05

  本文关键词：Na_2SeO_3诱导肿瘤细胞凋亡过程中硒醇和活性氧的检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：硒是人体必需的微量元素之一，与人体许多疾病密切相关。亚硒酸钠作为一种抗癌药物，能够有效地杀死肿瘤细胞，且对正常细胞的毒性较小。随着癌症发病率的提高，亚硒酸钠的抗癌功效引起更多的关注，但其抗癌的具体机制却还不清楚。大量研究认为，亚硒酸钠在代谢过程中，生成的硒醇与氧气反应产生活性氧，引起氧化应激从而导致肿瘤细胞死亡。但是在以往的研究过程中，，却忽略了实体肿瘤的缺氧微环境，在常氧的环境下进行了与氧化应激相关的各种信号通路的研究。因此，我们在乏氧条件下，利用新的荧光探针重新监测了亚硒酸钠诱导肿瘤细胞凋亡过程中硒醇和活性氧的含量变化，观察细胞内的氧化还原状态变化，试图在真正的肿瘤微环境下来对亚硒酸钠的抗癌机制进行研究。 本文综述了硒醇探针和双组分同时检测的研究现状及发展趋势，以亚硒酸钠诱导肝癌细胞凋亡过程为细胞模型，利用金纳米粒子和肽链设计了新型的检测硒醇的纳米探针，并实现了在同一激发下，对硒醇和活性氧的同时检测。具体工作内容主要分为以下三个方面： 1、设计了一种新型的近红外检测硒醇的金纳米探针，并进行了生物成像分析。本探针是在金纳米粒子的表面通过Au-S键组装上修饰了近红外染料的肽链（N端Cy5.5，C端半胱氨酸裸露巯基），金纳米粒子与染料之间发生FRET，染料的荧光被金猝灭，由于硒醇更强的亲核性能，能够与巯基之间发生竞争反应，形成更加稳定的Au-Se键，使连接了Cy5.5的肽链被置换下来，荧光恢复，从而实现对硒醇的特异性检测。 该探针的激发发射均在近红外区，避开了生物体自体荧光的干扰，与以往的可见探针相比，具有较大的优势。首次利用硒醇与纳米金之间更易于成键的能力来设计探针，生物体内含有的一些还原性物质、氧化性物质、氨基酸、金属离子等均没有干扰，具有较高的选择性和灵敏度。在0~100μM的浓度范围内，随着硒醇浓度的增高，荧光增强，并且有很好的线性关系，线性方程为F=1623.3+170.18[Sec] μM，线性相关系数为0.9902。通过细胞毒性试验可以看出该金纳米探针具有良好的生物相容性和较低的毒性，并且在缺氧的条件下，也能够很好的检测到亚硒酸钠诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇的含量变化。 2、检测硒醇的可见金纳米探针的设计合成及生物应用。亚硒酸钠在人体内代谢产生硒醇和活性氧，因此，在乏氧下实现对硒醇和活性氧的同时检测，有助于对亚硒酸钠抗癌机制的研究。基于在同一激发，不同发射下进行双检测的目的，我们利用Au-Se键竞争取代Au-S键，设计了一种FAM修饰的波长匹配的检测硒醇的金纳米探针，激发发射均在可见区（Ex=490nm, Em=520nm)。之后分别在化学体系和生物模型中对探针的性能进行分析，发现探针能够特异性的检测硒醇，不受生物体内含有的一些还原性物质、氧化性物质、氨基酸、金属离子等的干扰，具有较高的选择性和灵敏度。在0~100μM的浓度范围内，荧光强度随硒醇的浓度增加，有很好的线性关系，线性方程为F=2729.79+308.65[Sec] μM，线性相关系数为0.9959。该金纳米探针具有良好的生物相容性和较低的毒性，能够在缺氧的条件下，检测亚硒酸钠诱导肿瘤细胞凋亡过程中硒醇的含量变化。 3、同一激发下，硒醇与H2O2的同时检测。在上一章的研究基础上，选择合成了一种以反花菁染料为荧光母体，苯硼酸酯为响应基团的特异性检测H2O2的小分子探针（QCy7)，该探针与H2O2反应后的光谱具有双激发、单发射的特点（Ex1=490nm，Ex2=560nm，Em=710nm)，与上一章中的检测硒醇可见探针激发光谱重叠，发射光谱分离，在化学体系很好地实现同一激发下的双检测，两种探针之间相互不干扰。在常氧/乏氧条件下，在亚硒酸钠抗癌药物的诱导下，检测了肝癌细胞中硒醇和活性氧的变化情况。实验结果发现，在常氧条件下，随着亚硒酸钠诱导时间的增加，细胞内的硒醇和H2O2含量均明显上升；乏氧时，随着亚硒酸钠诱导时间的增加，细胞内的硒醇含量增加，H2O2含量则无明显变化。推测原因是因为在乏氧的肿瘤微环境下，氧气的含量较低，无法与硒醇作用产生更多的活性氧。实验结果在一定程度上说明了亚硒酸钠诱导肿瘤细胞的凋亡，不是由一个氧化应激过程，而是由细胞内硒醇含量过高引起的还原胁迫造成的，这为以后研究亚硒酸钠的抗癌机制，提供了一个新的思路。
【关键词】：亚硒酸钠 硒醇 H2O2 金纳米探针 还原胁迫
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-36;O657.3
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 绪论11-31
• 1、硒与癌症11-16
• 1.1 硒的生理作用11-12
• 1.2 亚硒酸钠作为一种具有前景的抗肿瘤药物12
• 1.3 亚硒酸钠氧化应激抗癌机制的研究12-14
• 1.4 硒醇的荧光检测进展14-16
• 2、纳米金概述16-20
• 2.1 纳米金的特性16-17
• 2.2 纳米金在生物传感上的应用17-20
• 3、多组分同时检测20-22
• 3.1 多组分同时检测的意义20
• 3.2 多组分同时检测研究现状20-22
• 4、论文的选题背景和研究意义22-25
• 参考文献25-31
• 第二章 硒醇近红外金纳米探针的设计合成及生物成像31-54
• 摘要31
• 1、引言31-33
• 2、实验部分33-38
• 2.1 仪器与试剂33
• 2.2 肽链的合成33-34
• 2.3 金纳米粒子的制备34
• 2.4 纳米探针（Cy5.5-peptide-AuNPs）的制备34
• 2.5 纳米探针上组装的肽链数量的确定34-35
• 2.6 纳米探针的化学体系分析35-36
• 2.6.1 硒醇的配制方法35
• 2.6.2 探针荧光光谱的测定35-36
• 2.6.3 探针反应动力学36
• 2.6.4 探针与硒醇的响应36
• 2.6.5 探针的选择性测定36
• 2.7 纳米探针的生物体系分析36-38
• 2.7.1 细胞培养36
• 2.7.2 MTT 实验36-37
• 2.7.3 纳米探针的抗光漂白实验37
• 2.7.4 硒醇的荧光共聚焦成像37
• 2.7.5 Na_2SeO_3的细胞毒性实验37
• 2.7.6 在乏氧下研究 Na_2SeO_3诱导 HepG_2 细胞凋亡过程中硒醇含量的变化37-38
• 3、结果与讨论38-49
• 3.1 金纳米粒子及纳米金探针的合成及表征38-39
• 3.2 纳米金探针的肽链负载量39-40
• 3.3 纳米金探针的光谱性质40
• 3.4 纳米金探针与硒醇反应的动力学40-41
• 3.5 pH对纳米金探针反应的影响41-42
• 3.6 纳米金探针对硒醇的荧光响应42
• 3.7 纳米金探针的选择性评价42-45
• 3.8 纳米探针的细胞毒性试验（MTT）45-46
• 3.9 纳米探针的抗光漂白实验46
• 3.10 HepG_2 细胞中硒醇的荧光成像46-47
• 3.11 Na_2SeO_3的细胞毒性实验47-48
• 3.12 在乏氧下研究 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇含量的变化48-49
• 3.12.1 不同浓度 Na_2SeO_3诱导 HepG_2 细胞48-49
• 3.12.2 Na_2SeO_3诱导 HepG_2 细胞不同时间49
• 4、本章小结49-51
• 参考文献51-54
• 第三章 硒醇可见金纳米探针的设计合成及生物应用54-73
• 摘要54
• 1、引言54-55
• 2、实验部分55-60
• 2.1 仪器与试剂55-56
• 2.2 肽链的合成56
• 2.3 金纳米粒子的制备56
• 2.4 纳米探针（5-FAM-peptide-AuNPs）的制备56-57
• 2.5 纳米探针上组装的肽链数量的确定57
• 2.6 纳米探针的化学体系分析57-58
• 2.6.1 待测物的配制方法57
• 2.6.2 探针荧光光谱的测定57-58
• 2.6.3 探针反应动力学58
• 2.6.4 探针与硒醇的响应58
• 2.6.5 探针的选择性测定58
• 2.7 纳米探针的生物体系分析58-60
• 2.7.1 细胞培养58
• 2.7.2 MTT 实验58-59
• 2.7.3 纳米探针的抗光漂白实验59
• 2.7.4 HepG_2 细胞中硒醇的荧光共聚焦成像59
• 2.7.5 在乏氧下研究 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇含量的变化59-60
• 3、结果与讨论60-70
• 3.1 金纳米粒子及纳米金探针的合成及表征60
• 3.2 纳米金探针的肽链负载量60-61
• 3.3 纳米金探针的光谱性质61-62
• 3.4 纳米金探针与硒醇反应的动力学62
• 3.5 pH对纳米金探针反应的影响62-63
• 3.6 纳米金探针对硒醇的荧光响应63-64
• 3.7 纳米金探针的选择性评价64-66
• 3.8 纳米探针的细胞毒性试验（MTT）66-67
• 3.9 纳米探针的抗光漂白实验67
• 3.10 HepG_2 细胞中硒醇的荧光成像67-68
• 3.11 在乏氧下研究 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇含量的变化68-70
• 3.11.1 不同浓度 Na_2SeO_3诱导 HepG_2 细胞68-69
• 3.11.2 Na_2SeO_3诱导 HepG_2 细胞不同时间69-70
• 4、结论70-71
• 参考文献71-73
• 第四章 亚硒酸钠诱导肿瘤细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的同时检测（同一激发）73-91
• 摘要73
• 1、引言73-74
• 2、实验部分74-79
• 2.1 仪器与试剂74-75
• 2.2 反花菁探针 QCy7 的合成路线[1]75
• 2.3 反花菁荧光探针 QCy7 的合成与表征75-76
• 2.4 反花菁荧光探针 QCy7 的化学体系分析76-77
• 2.4.0 探针储备液的配制方法76
• 2.4.1 反花菁荧光探针 QCy7 的光谱性质76-77
• 2.4.2 反花菁荧光探针 QCy7 与 H2O2的响应77
• 2.4.3 硒醇对反花菁荧光探针 QCy7 的干扰测定77
• 2.5 化学体系中硒醇与 H2O2的同时检测77-78
• 2.5.1 两种探针的光谱叠加77
• 2.5.2 两种探针的混合液对硒醇的响应77-78
• 2.5.3 两种探针的混合液对 H2O2的响应78
• 2.6 两种探针在 HepG_2 细胞内的共成像78
• 2.7 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的双检测78-79
• 2.7.1 常氧条件下 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的双检测78
• 2.7.2 乏氧条件下 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的双检测78-79
• 3、结果与讨论79-87
• 3.1 反花菁荧光探针 QCy7 反应后光谱性质79
• 3.2 反花菁荧光探针 QCy7 与 H2O2的响应79-80
• 3.3 硒醇对反花菁荧光探针 QCy7 的干扰测定80-81
• 3.4 化学体系中硒醇与 H2O2的同时检测81-83
• 3.4.1 两种探针的光谱叠加81
• 3.4.2 两种探针的混合液对硒醇的响应81-82
• 3.4.3 两种探针的混合液对 H2O2的响应82-83
• 3.5 两种探针在细胞内的共成像83-84
• 3.6 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的同时检测84-87
• 3.6.1 常氧条件下 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的同时检测84-85
• 3.6.2 乏氧条件下 Na_2SeO_3诱导肝癌细胞凋亡过程中硒醇和 H2O2的同时检测85-87
• 4、结论87-88
• 参考文献88-91
• 附图：肽链及合成产物谱图91-95
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文和参与的课题95-96
• 致谢96

【共引文献】

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  本文关键词：Na_2SeO_3诱导肿瘤细胞凋亡过程中硒醇和活性氧的检测，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：334903