基于适配体—纳米金双模式生物传感器的鱼小清蛋白快速检测研究

发布时间：2023-05-05 18:35

　　近年来,由于经济的快速发展和人民生活水平的提高,食物过敏日益受到消费者的重视。其中,鱼类由于味道鲜美、来源广泛、营养经济价值高而受到广大消费者的欢迎,但鱼却是易引起食物过敏反应的八大类食品之一。报道显示,13%以上的食物过敏由鱼类引起,而其中90%是由鱼类中的小清蛋白导致。小清蛋白具有很强的耐高温、耐酶解特性,难以通过普通的食品加工及烹饪过程消除其致敏原性。目前,小清蛋白的定量检测方法主要有ELISA法和PCR法。然而,这两类方法均存在前处理复杂、操作成本高、测试时间长等一系列局限性。基于上述问题,本研究旨在构建一种可以快速、准确检测小清蛋白的双模式生物传感器。主要研究内容如下:(1)通过组合浸提、硫酸铵沉淀和DEAE离子交换层析等方法提取及纯化鳕鱼中的小清蛋白。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA及免疫印迹技术分析表征目标纯化蛋白的性质,并结合质谱对小清蛋白进行确证。结果显示,经上述方法提取的小清蛋白的纯度达99%以上,分子量为11.5 kDa,具有较强的免疫活性反应。(2)采用免固定化氧化石墨烯筛选法(GO-SELEX),在随机ssDNA文库中筛选能够特异性识别小清蛋白的核酸适配体。...

【文章页数】：103 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写及中英文对照表
第1章 引言
    1.1 鱼类致敏原及其检测概况
        1.1.1 食物过敏
        1.1.2 鱼类主要致敏原
        1.1.3 鱼类致敏原检测方法研究进展
    1.2 核酸适配体在食品安全检测中的研究进展
        1.2.1 核酸适配体
        1.2.2 核酸适配体筛选方法
        1.2.3 核酸适配体在食品安全检测领域的应用
    1.3 纳米金在食品安全检测中的研究进展
        1.3.1 纳米金
        1.3.2 纳米金在食品安全检测中的应用
    1.4 主要研究内容及意义
        1.4.1 研究意义及目的
        1.4.2 研究内容
        1.4.3 技术路线
第2章 鱼小清蛋白提纯、鉴定和结构分析
    2.1 前言
    2.2 仪器与试剂
        2.2.1 实验对象
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 实验试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 鱼小清蛋白的提取
        2.3.2 鱼小清蛋白的纯化
        2.3.3 BCA法浓度分析
        2.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
        2.3.5 高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)鉴定
        2.3.6 紫外-可见光光谱(UV-vis)分析
        2.3.7 圆二色光谱(CD)分析
        2.3.8 傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析
        2.3.9 酶联免疫吸附实验(ELISA)分析
        2.3.10 蛋白质印迹法(Western Blot)分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 鱼小清蛋白初步纯化结果
        2.4.2 DEAE Sepharose FF离子交换柱纯化鱼小清蛋白
        2.4.3 SDS-PAGE分析鱼小清蛋白纯度
        2.4.4 HPLC-MS/MS分析鱼小清蛋白
        2.4.5 UV-vis分析鱼小清蛋白
        2.4.6 鱼小清蛋白二级结构分析
        2.4.7 鱼小清蛋白免疫原性分析
    2.5 小结
第3章 鱼小清蛋白核酸适配体的筛选
    3.1 前言
    3.2 仪器与试剂
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 实验试剂
        3.2.3 随机ssDNA文库,引物和适配体序列
    3.3 实验方法
        3.3.1 氧化石墨烯法(GO-SELEX)筛选
        3.3.2 高通量测序分析
        3.3.3 生物膜干涉技术(BLI)分析
        3.3.4 氧化石墨烯荧光法分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 氧化石墨烯表征
        3.4.2 氧化石墨烯与随机ssDNA文库吸附条件优化
        3.4.3 PCR扩增条件的优化
        3.4.4 PCR产物纯化与酶切
        3.4.5 荧光定量PCR(q PCR)法确定GO-SELEX筛选轮数
        3.4.6 高通量测序结果分析
        3.4.7 生物膜干涉技术(BLI)亲和力分析
        3.4.8 氧化石墨烯荧光法特异性分析
    3.5 小结
第4章 基于适配体-纳米金双模式生物传感器的鱼小清蛋白快速检测研究
    4.1 前言
    4.2 仪器与试剂
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 实验试剂
        4.2.3 ssDNA序列
    4.3 实验方法
        4.3.1 纳米金的制备与表征
        4.3.2 AuNPs-DNA探针的制备与表征
        4.3.3 基于适配体-纳米金双模式生物传感器的鱼小清蛋白快速检测方法构建
        4.3.4 基于适配体-纳米金双模式生物传感器的鱼小清蛋白快速检测方法学考察
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 纳米金理化性质研究
        4.4.2 AuNPs-DNA探针表征
        4.4.3 适配体-纳米金双模式生物传感器的优化
        4.4.4 基于适配体-纳米金双模式生物传感器检测鱼小清蛋白方法学考察
    4.5 小结
第5章 总结与展望
    5.1 总结
    5.2 创新点
    5.3 展望
参考文献
后记



本文编号：3808178