牛奶中三聚氰胺的ELISA和可视化纳米金快速检测技术研究

发布时间：2017-05-24 09:02

  本文关键词：牛奶中三聚氰胺的ELISA和可视化纳米金快速检测技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食品安全直接关系到人类的健康和生命安全，是关乎国计民生的大事，是当今全世界共同关注的重大问题。我国食品安全问题正面临着严峻的挑战，尤其是乳制品行业。2008年发生的三鹿奶粉违法添加三聚氰胺事件，使得食品安全问题再次成为全民关注的焦点。为解决现有常规检测技术难以满足现场和快速检测需要的缺陷，研究建立快速、简便的三聚氰胺检测方法对保证乳制品的质量安全，维护人民的身体健康和消费者的合法权益，促进奶制品行业的健康发展均具有十分重要的社会意义和应用价值。本研究以三聚氰胺为靶标物，分别基于免疫学原理与纳米金显色技术设计建立两种快速检测方法。 1.三聚氰胺半抗原的改造及鉴定，完全抗原的合成及鉴定 首先对三聚氰胺半抗原进行改造，选用三聚氰胺的衍生物（2-氯-4,6-二氨-1,3,5-三嗪）对其进行羧基化修饰，用3-巯基丙酸取代三聚氰胺结构上的氯原子，并对改造后的羧基化三聚氰胺进行核磁共振-氢谱、碳谱及质谱鉴定。通过活性酯法将羧基化三聚氰胺与载体蛋白BSA、OVA分别进行偶联，合成三聚氰胺完全抗原（MEL-BSA、MEL-OVA）。对获得的完全抗原进行SDS-PAGE及质谱鉴定，表明三聚氰胺完全抗原制备成功。 2.三聚氰胺多抗制备及ELISA研究方法的初步建立 用获得的完全抗原进行实验动物免疫，采用MEL-BSA与等量弗氏佐剂(FA)混合，小剂量中程免疫的方法免疫6周龄雌性Balb/C小鼠，免疫间隔时间为两周，免疫小鼠分A、B两组各6只，不同剂量同步免疫。每次免疫后断尾采血，间接ELISA测定抗血清的效价，结果显示四免后B组抗血清效价均达到或高于1:20000，且抗血清对目标小分子具有较高特异性和亲和力。随后对B组小鼠进行加强免疫，并于免疫7天后眼眶采血，经免疫亲和层析柱纯化后得到多克隆抗体。建立针对三聚氰胺的间接ELISA分析方法，测得其回归方程为：Y=-46.8376+27.4957X，R2为0.9938，经计算得出其灵敏度（IC50）值为3.33mg/kg，最低检出限（LOD）为0.117mg/kg，检测区间在0.270～41.02mg/kg。通过与三嗪类及结构功能类似物的交叉反应实验，验证所制备的抗体具有较好的特异性。精密度实验表明该方法的重复性较好，为ELISA检测方法的建立奠定了基础。 3.基于纳米金探针快速可视化检测牛奶中三聚氰胺的方法研究 本实验以纳米金颗粒(gold nanoparticles，Au NPs)为探针，研究建立了一种高效、可靠、低成本的比色检测牛奶中三聚氰胺的方法，并基于此方法设计研发了三聚氰胺快速检测试剂盒。其原理是由于三聚氰胺可通过氢键作用快速诱导纳米金聚集，从而引起纳米金光学性质改变，表现为随着三聚氰胺浓度增大，纳米金溶液颜色由酒红色向蓝紫色变化，从而反映受检样品中三聚氰胺的浓度。本实验用硼氢化钠法及柠檬酸钠法制备不同粒径的Au NPs，并通过肉眼、可见光谱及透射电镜法对其进行表征。随后考察了纳米金检测方法的灵敏度、稳定性及聚集动力学，实验结果表明，5nm粒径的Au NPs最适合作为检测探针。在此基础上，对纳米金探针的各方面性能进行了测试，结果表明纳米金探针具有较好的选择性和抗干扰能力；同时对样品的前处理方法进行优化，不仅可以满足纳米金对三聚氰胺快速检测的要求，而且也可以达到简化操作过程提高检测效率的目的。从而建立了基于Au NPs的快速可视化检测牛奶中三聚氰胺的方法。 4.基于纳米金探针快速可视化检测牛奶中三聚氰胺的试剂盒研发 实验方法建立后，，以Au NPs为探针设计研发了三聚氰胺比色检测试剂盒。本实验首先是用硼氢化钠法制备5nm粒径的Au NPs，并制作标准比色卡，该标准比色卡是通过一系列含有不同浓度的MEL牛奶标样与5nm的Au NPs显色反应后的色差制备。该方法在一定程度上克服了传统检测中存在的问题，比现有方法简便易行，反应迅速，无需仪器，在室温条件下，从样品预处理到结果检出只需10min，通过肉眼判别比色卡实现了对牛奶中三聚氰胺的定性和半定量化检测，其检测范围是1~120mg/L，其检出限已达到了国标要求。当与紫外可见分光光度计联用时，最大吸收峰发生红移，在三聚氰胺浓度为0.2~20mg/L之间时表现了很好的线性关系，其检出限可达0.2mg/L；同时稳定性实验验证该试剂盒在室温下有效期可达一年；通过与高效液相色谱/质谱法（HPLC-MS）的比对实验分析，其检测结果接近。因此，本研究成功建立了用于现场快速筛查和定性、半定量检测液体奶、婴儿配方奶粉和其它奶制品中三聚氰胺的方法，并研发了具有自主知识产权的国产化三聚氰胺检测试剂盒。
【关键词】：三聚氰胺 酶联免疫吸附试验 纳米金颗粒 可视化 试剂盒
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TS252.7;O652
【目录】：

• 缩略词表8-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 前言15-26
• 1 概述15-18
• 1.1 三聚氰胺检测概述15-18
• 1.1.1 理化性质15-16
• 1.1.2 毒副作用16
• 1.1.3 食品安全事件16-17
• 1.1.4 三聚氰胺限量标准17
• 1.1.5 检测方法17-18
• 2、主要研究思路和方法18-25
• 2.1 生物检测法18-22
• 2.1.1 研究技术路线18-19
• 2.1.2 主要研究方法19-22
• 2.2 纳米金检测法22-25
• 2.2.1 研究技术路线22-23
• 2.2.2 主要研究方法23-25
• 3 研究目的和意义25-26
• 第一章 三聚氰胺半抗原的改造及鉴定，完全抗原的合成及鉴定26-39
• 1 材料26-29
• 1.1 主要试剂26
• 1.2 主要仪器及耗材26-27
• 1.3 主要溶液的配制27-29
• 1.3.1 抗原制备相关溶液的配制27
• 1.3.2 SDS-PAGE 相关溶液的配制27-29
• 2 方法29-32
• 2.1 三聚氰胺半抗原的改造29-30
• 2.2 三聚氰胺完全抗原的制备30
• 2.3 三聚氰胺完全抗原的鉴定30-32
• 2.3.1 SDS-PAGE 法分析30-32
• 2.3.2 质谱分析32
• 3 结果与分析32-38
• 3.1 三聚氰胺半抗原的鉴定32-36
• 3.1.1 核磁共振氢谱分析32-34
• 3.1.2 核磁共振碳谱分析34-35
• 3.1.3 质谱分析35-36
• 3.2 三聚氰胺完全抗原的鉴定36-38
• 3.2.1 SDS-PAGE 分析36-37
• 3.2.2 质谱分析37-38
• 4 讨论38-39
• 第二章 抗 MEL 多抗的制备及其 ELISA 研究方法的初步建立39-52
• 1 材料39-41
• 1.1 实验动物39
• 1.2 主要试剂39
• 1.3 主要仪器及耗材39-40
• 1.4 主要溶液的配制40-41
• 1.4.1 多抗制备相关溶液的配制40
• 1.4.2 ELISA 相关溶液的配制40-41
• 2 方法41-46
• 2.1 抗 MEL 抗体的制备与鉴定41-43
• 2.1.1 动物免疫41-42
• 2.1.1.1 免疫设计41
• 2.1.1.2 免疫方案41-42
• 2.1.1.3 免疫乳化剂的制备42
• 2.1.1.4 动物采血42
• 2.1.2 抗血清效价测定42-43
• 2.1.3 抗血清特异性测定43
• 2.2 抗血清的鉴定43-44
• 2.3 抗血清的收集与保存44
• 2.4 ELISA 方法的研究建立44-46
• 2.4.1 最佳抗体浓度与包被浓度的确定44
• 2.4.2 标准曲线的绘制44-45
• 2.4.3 方法特异性试验45
• 2.4.4 方法精密度试验45-46
• 3 结果与讨论46-51
• 3.1 抗血清的性质鉴定46-48
• 3.1.1 抗血清效价测定46-47
• 3.1.2 抗血清特异性测定47-48
• 3.2 ELISA 研究方法的建立48-51
• 3.2.1 最佳包被浓度与抗体浓度的确定48-49
• 3.2.2 标准曲线的绘制49
• 3.2.3 方法特异性试验49-51
• 3.2.4 方法精密度试验51
• 4 小结与讨论51-52
• 第三章 基于纳米金探针快速可视化检测牛奶中三聚氰胺的方法研究52-69
• 1 材料52-53
• 1.1 主要试剂52
• 1.2 主要仪器及耗材52-53
• 1.3 主要溶液的配制53
• 2 方法53-56
• 2.1 纳米金的制备53-54
• 2.1.1 制备不同粒径的纳米金53-54
• 2.1.2 纳米金制备的注意事项54
• 2.2 纳米金的表征54-55
• 2.3 纳米金在实际样品中检测应用55-56
• 2.3.1 样品前处理55-56
• 2.3.2 标准比色卡的制作56
• 2.3.3 实际样品检测56
• 3 结果与分析56-67
• 3.1 纳米金的制备56-59
• 3.1.1 还原剂种类及加入量对纳米金制备的影响56-58
• 3.1.2 反应时间对纳米金制备的影响58-59
• 3.1.3 搅拌方式及强度对纳米金制备的影响59
• 3.2 纳米金的表征59-61
• 3.3 纳米金的粒径选择61-63
• 3.3.1 纳米金的灵敏度61-62
• 3.3.2 纳米金的稳定性62-63
• 3.3.3 纳米金的聚集动力学63
• 3.4 类似物的选择性63-64
• 3.5 纳米金的抗干扰能力64-65
• 3.6 样品前处理优化65
• 3.7 最低检出限和检测区间的确定65-66
• 3.8 与紫外可见分光光度计联用定量检测三聚氰胺66-67
• 4 结论67-69
• 第四章 基于纳米金探针快速可视化检测牛奶中三聚氰胺的试剂盒研发69-77
• 1 材料69-70
• 1.1 主要试剂69
• 1.2 主要仪器及耗材69-70
• 1.3 主要溶液的配制70
• 2.方法70-72
• 2.1 制备 5nm 粒径的纳米金70
• 2.2 纳米金的表征70
• 2.3 乳制品样品前处理70-71
• 2.4 试剂盒稳定性测试71
• 2.5 样品测定方法71
• 2.6 加标回收及比对实验71
• 2.7 三聚氰胺快速检测试剂盒的构造71-72
• 3 结果与分析72-76
• 3.1 纳米金的表征72-73
• 3.2 试剂盒的稳定性73-74
• 3.3 实际样品前处理74
• 3.4 纳米金探针在实物中的应用74-75
• 3.5 验证实验75-76
• 4 结论76-77
• 结论与展望77-79
• 参考文献79-84
• 文献综述84-92
• 参考文献90-92
• 在学期间发表文章92
• 个人简历92-94
• 致谢94

【参考文献】

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  本文关键词：牛奶中三聚氰胺的ELISA和可视化纳米金快速检测技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：390291