肝靶向NO荧光探针设计、合成及其生物成像研究

发布时间：2017-07-19 18:36

  本文关键词：肝靶向NO荧光探针设计、合成及其生物成像研究

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【摘要】：一氧化氮(NO)是非常重要的生物活性分子,其在生理学和病理学过程中起着至关重要的作用,NO由一氧化氮合酶(NOS)氧化L-精氨酸而生成。NO释放量紊乱会引发多种疾病,如在心血管系统中会引发动脉粥样硬化,高血压等；在神经系统中,其对脑部的成熟和发育,学习以及记忆等方面具有重要作用,当NO释放过量时,会引起老年痴呆病和帕金森综合症；在免疫系统中,NO却可以充当杀毒、杀菌作用,其不仅可以防御入侵人体的微生物和细菌等,而且还可以抑制癌细胞扩散。同样NO水平在肝中起着非常重要的作用,肝组织中NO水平异常会导致肝组织功能发生紊乱,如肝纤维化、肝硬化和肝癌等疾病。为了更好地理解NO的生理和病理功能,迫切需要具有灵敏度、能够在复杂生物系统中(如活细胞,肝等深层组织)定量检测NO水平的技术。与传统的检测方法相比,荧光检测技术因其灵敏度高、选择性好和低检测下限等优点被广泛应用在化学、材料、生物和医学等领域。目前主要有靶向检测线粒体和溶酶体中NO的荧光探针。尚未见报道靶向肝中NO的文献,然而NO与肝组织的正常工作有着密切关联,而且目前还未揭示生物学上NO在肝组织中的作用机制,主要由于缺少定位检测肝中NO的探针。鉴于上述情况,我们设计并合成了靶向定位检测肝中NO的增强型荧光探针Gal-RhB,并通过实验测试初步评估了其应用价值。该荧光探针是以罗丹明B为荧光基团,邻苯二胺为识别基团,接上半乳糖作为靶向定位肝的基团。同时接上半乳糖使该探针具有良好的水溶性,可以减小荧光探针与肝中的蛋白质等分子的非特异性结合。该荧光探针可以与肝表面的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP)特异性结合,使荧光探针可以检测生物体内肝中NO。在NO作用下,荧光探针Gal-RhB的邻苯二胺结构从罗丹明上断裂,罗丹明结构可以发生开环,荧光探针Gal-RhB检测液转变为粉红色。荧光探针Gal-RhB对NO具有高选择性和抗干扰性,具有良好水溶性,探针对pH的稳定性非常好,响应速度非常快,7分钟反应完全。从pH稳定性实验表明,该荧光探针可以适用于生理条件pH对NO的检测,当NO浓度在0-500 nM之间时,荧光探针在580 nm处荧光强度与NO浓度呈现出非常良好的线性关系,且探针Gal-RhB检测最低下限值为1.62 nM,检测灵敏度非常高。MTT实验表明探针Gal-RhB的细胞毒性小,可用于活细胞中对NO进行荧光成像。用细胞荧光成像结果表明：对肝癌细胞具有特异性靶向作用,探针能够检测肝癌细胞中NO。活体斑马鱼荧光成像表明：荧光探针Gal-RhB可以靶向定位斑马鱼中肝组织中NO。对于研究肝组织中NO作用机理具有非常重要的指导意义。
【关键词】：罗丹明 一氧化氮 肝 荧光探针 斑马鱼 细胞成像
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 绪论11-39
• 1.1 前言11
• 1.2 荧光分子探针11-13
• 1.2.1 识别基团12
• 1.2.2 报告基团12-13
• 1.2.3 连接基团13
• 1.3 荧光分子探针的信号传递机制13-24
• 1.3.1 荧光共振能量转移(FRET)13-15
• 1.3.2 分子内电荷转移(ICT)15-17
• 1.3.3 光诱导电子转移(PET)17-19
• 1.3.4 激发态分子内质子转移(ESIPT)19-20
• 1.3.5 单体-激基缔合物20-22
• 1.3.6 聚集诱导发光(AIE)22-24
• 1.4 罗丹明类荧光探针在检测中的应用24-31
• 1.4.1 罗丹明类荧光探针的介绍24-25
• 1.4.2 罗丹明对金属离子的检测25-28
• 1.4.3 基于罗丹明对活性氧和活性氮的检测28-31
• 1.5 检测NO的荧光分子探针31-36
• 1.5.1 基于邻苯二胺PET效应与NO成环反应的荧光探针31-33
• 1.5.2 NO致使内酰胺环开环的荧光分子探针33-35
• 1.5.3 NO与金属络合物反应的荧光分子探针35-36
• 1.6 肝的介绍36-37
• 1.7 本课题的研究背景、意义及研究内容37-39
• 第二章 荧光探针的合成及表征39-54
• 2.1 引言39
• 2.2 实验部分39-46
• 2.2.1 主要原料与试剂39-40
• 2.2.2 主要实验仪器和测试40
• 2.2.3 探针的合成与制备40-45
• 2.2.4 荧光探针的光谱性能测试45-46
• 2.3 结果与讨论46-53
• 2.3.1 Anp-2的结构表征46-47
• 2.3.2 RhB-Anp5的结构表征47-49
• 2.3.3 RhB-Gal6的结构表征49-50
• 2.3.4 探针Gal-RhB的结构表征50-52
• 2.3.5 荧光探针Gal-RhB的光谱性能分析52-53
• 2.4 本章小结53-54
• 第三章 NO荧光探针的性能研究及其生物成像应用54-77
• 3.1 引言54
• 3.2 实验部分54-61
• 3.2.1 原料与试剂54-55
• 3.2.2 实验仪器及测试55-56
• 3.2.3 探针Gal-RhB的光谱学性能测试56-58
• 3.2.4 探针Gal-RhB的MTT毒性实验58-59
• 3.2.5 细胞培养及其荧光成像59-60
• 3.2.6 斑马鱼培养及其荧光成像60-61
• 3.3 结果与讨论61-75
• 3.3.1 探针Gal-RhB的荧光光谱分析61-66
• 3.3.2 荧光探针对pH稳定性66-67
• 3.3.3 选择性和干扰性67-68
• 3.3.4 反应机理验证68-70
• 3.3.5 细胞毒性70-71
• 3.3.6 细胞荧光成像71-73
• 3.3.7 斑马鱼荧光成像73-75
• 3.4 本章小结75-77
• 结论77-78
• 参考文献78-92
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果92-93
• 致谢93-94
• 答辩委员会对论文的评定意见94

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本文编号：564302