基于链替代信号放大技术灵敏检测疾病相关靶分子的研究

发布时间：2017-08-03 07:03

  本文关键词：基于链替代信号放大技术灵敏检测疾病相关靶分子的研究

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【摘要】：核酸和蛋白质是组成生物体的两种重要大分子物质,在生物体的生命活动中发挥至关重要的作用。因此对于这两类生物大分子的分析检测已经发展成为当代生物分析化学的研究热点。追求简单、灵敏、稳定、特异性好的分析检测方法是当前研究的重点。目前基于核酸探针的信号放大技术大都是利用各种工具酶和纳米材料进行信号放大实现分析物的灵敏测定,但是在此过程中往往需要引入其他的辅助酶,费用较高,同时需要严格控制酶的存储以及操作条件。另外对于复杂体系中样品测定,有较强的背景干扰,不利于测定。因此,如何建立新的抗干扰的生物信号放大检测技术平台以及新的信号转换方式,来更好的解决生物分子分析过程中存在的上述问题,仍是研究的热点以及难点。本工作,基于无需酶辅助的链替代信号放大技术,结合新的信号转换方式和微磁球的表面固定化,构建了一系列新方法用于蛋白质以及核酸的灵敏测定。主要研究内容和结果可归纳为以下两个方面：一、基于双重信号放大技术检测T4多聚核苷酸激酶活性及抑制荧光法的研究基于链替代和环糊精增敏作用的双重信号放大技术,以对距离敏感的芘分子作为信号转换元件,建立了一种均相、灵敏、快速检测T4多聚核苷酸激酶(PNK)活性以及抑制的荧光法。以非标记的发卡探针H1作为PNK的底物,单标记的发卡探针H2、H3作为信号探针。在RNK、lambda核酸外切酶(λexo)存在时,以磷酸化诱导的λexo切割作用所释放的DNA作为链替代反应的引发链,打开发卡探针H2。打开的探针H2接着打开探针H3,形成H2/H3杂交双链的同时重新释放出引发链,使得芘分子单体相互靠近,形成芘分子二聚体,体系荧光信号增强,实现第一步信号放大。随后加入γ-环糊精(γ-CD),由于γ-CD可以保护芘分子二聚体的荧光不受周围环境干扰,同时可进一步拉近二聚体分子间的距离,使得芘分子二聚体的荧光信号进一步增强,实现第二步信号放大。基于上述双重信号放大技术,PNK活性检测的线性范围为0.0005-5 U/mL,检出限9.3×10-5U/mL。不同抑制剂对于PNK活性影响的研究表明该方法还可以用于抑制剂筛选。因此,该方法是一种简单、灵敏、快速的PNK活性检测以及酶抑制剂研究的荧光法。二、基于链替代循环放大法灵敏检测端粒酶RNA流式法的研究基于磁性微球(MB)的可控磁分离和链替代反应信号放大作用,建立了-种简单、灵敏、抗干扰的检测端粒酶RNA(hTR)的流式新方法。首先,将生物素化的发卡探针H1固定到链霉亲和素化的磁性微球(MB)表面,通过磁分离除掉多余H1。当目标物不存在时,发夹探针H1与H2在溶液中保持自身的发夹结构,链替代反应无法发生,荧光标记的H2探针不能富集到磁性微球(MB)表面。当目标hTR存在时,hTR能够打开探针H1,打开的探针H1可以与一端标记羧基荧光素的探针H2发生链替代反应,在磁珠表面形成H1/H2的杂交双链。替代下来的hTR循环引发链替代反应,使得荧光信号在磁性微球表面富集。通过该链替代信号放大作用,目标物的检测线性范围为0.001 nM到1 nM,检出限为0.0003nM。同时该方法还能区分单碱基突变。因此该方法是一种简单、快速、稳定检测端粒酶RNA的流式法。
【关键词】：磷酸化 荧光 流式法 端粒酶RNA(hTR) 链替代信号放大
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 绪论10-34
• 1.1 核酸和蛋白质检测的意义10
• 1.2 基于核酸探针的核酸和蛋白质的检测10-17
• 1.2.1 基于核酸探针的电化学检测途径11-12
• 1.2.2 基于核酸探针的比色检测途径12-13
• 1.2.3 基于核酸探针的表面增强拉曼散射检测途径13-15
• 1.2.4 基于核酸探针的荧光检测途径15-16
• 1.2.5 基于核酸探针的流式检测途径16-17
• 1.3 核酸探针信号放大技术及其在生物分析检测中的应用17-31
• 1.3.1 工具酶辅助的信号放大18-24
• 1.3.2 基于DNA自组装的信号放大24-27
• 1.3.3 基于纳米材料的信号放大的信号放大27-30
• 1.3.4 基于微磁球的信号放大30-31
• 1.4 选题依据及研究内容31-34
• 第2章 基于双重信号放大技术检测T4多聚核苷酸激酶活性及抑制荧光法的研究34-50
• 2.1 引言34-35
• 2.2 实验部分35-37
• 2.2.1 试剂和仪器35-36
• 2.2.2 实验步骤36-37
• 2.3 实验结果与讨论37-48
• 2.3.1 实验原理及验证37-42
• 2.3.2 条件优化42-44
• 2.3.3 选择性考察44-45
• 2.3.4 灵敏度考察45-46
• 2.3.5 抑制剂考察46-48
• 2.4 小结48-50
• 第3章 基于链替代循环放大检测端粒酶RNA流式法的研究50-64
• 3.1 引言50-51
• 3.2 实验部分51-53
• 3.2.1 试剂与仪器51-52
• 3.2.2 实验步骤52-53
• 3.3 实验结果与讨论53-62
• 3.3.1 实验原理及验证53-57
• 3.3.2 条件优化57-58
• 3.3.3 方法灵敏度考察58-60
• 3.3.4 选择性考察60-61
• 3.3.5 复杂体系中端粒酶RNA测定61-62
• 3.4 小结62-64
• 结论64-66
• 参考文献66-78
• 致谢78-80
• 攻读学位期间研究成果80

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本文编号：613098