乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法—荧光定量PCR法

发布时间：2017-08-06 16:20

  本文关键词：乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法—荧光定量PCR法

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【摘要】：结核分枝杆菌是引起结核病(Bovine tuberculosis)的重要人兽共患传染病病原,一直困扰世界奶牛养殖业的发展,危害着人类和动物健康,给社会造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织将其列为B类动物传染病,我国将其列为二类动物传染病。全世界各国每年均花费大量的人力、物力和财力去防制本病的发生。OIE指定的检测方法是结核菌素试验方法,但该方法受物理、化学以及生物因素影响,导致实验结果的特异性、敏感性不高;经典的细菌分离培养受到分枝杆菌生长缓慢的影响,检测周期长。对于出入境检验检疫,乳及乳制品中结核分枝杆菌的快速检测方法的建立又显得尤为重要。因此建立快速、灵敏、特异的检测乳及乳制品中结核分枝杆菌方法对于出入境检验检疫及本病的防控具有重要意义。本研究根据结核分支杆菌保守序列设计特异引物,建立了结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR检测法。对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行研究,结果表明:所建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好,得到标准曲线方程为y=-3.29x+38.6,相关系数为0.9980;敏感性高,可达1×102 copies/μL,亦可达10CFU/5mL。抗干扰能力强,仅结核分枝杆菌出现特异性扩增曲线。重复性良好,分别用不同浓度的标准质粒进行组内和组间平行试验,结果显示批内和批间的变异系数均小于1%。经大连动物疾病预防控制中心、吉林出入境检验检疫局、河南出入境检验检疫局、山东出入境检验检疫局、黑龙江出入境检验检疫局等5家单位验证,表明该实时荧光定量PCR方法能准确快速检测乳及乳制品中结核分枝杆菌,且建立的方法已成为检验检疫行业标准《SN/T 2101-2016出口乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法荧光定量PCR法》,标准将于2016年10月1日起实施。
【关键词】：结核病 结核分枝杆菌 荧光定量聚合酶链式反应 检测方法
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS252.7;O657.3
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 前言9-18
• 1.1 结核分枝杆菌9-16
• 1.1.1 分枝杆菌属的分类9-10
• 1.1.2 结核分枝杆菌生物学特征10-11
• 1.1.3 致病机制与所致疾病11
• 1.1.4 结核分枝杆菌独特的基因组11-12
• 1.1.5 结核分枝杆菌检测的研究进展12-16
• 1.2 荧光定量PCR16-17
• 1.3 原理17-18
• 2 材料与方法18-24
• 2.1 仪器和器材18
• 2.2 试剂18-19
• 2.3 样品处理19
• 2.3.1 抽样、采样工具19
• 2.3.2 样品采集19
• 2.3.3 样品贮运19
• 2.3.4 样品制备19
• 2.4 PCR产物的克隆19-20
• 2.4.1 PCR产物的回收19
• 2.4.2 PCR产物与克隆载体pGEM-T的连接19-20
• 2.4.3 JM l09感受态细胞的制备20
• 2.4.4 连接产物转化宿主菌20
• 2.5 阳性质粒的鉴定及序列的测定20-21
• 2.5.1 质粒的小量提取20
• 2.5.2 序列的测定和分析20-21
• 2.5.3 标准阳性质粒的制备21
• 2.6 方法21-24
• 2.6.1 DNA提取21-22
• 2.6.2 样本的处理22
• 2.6.3 反应体系的配制22
• 2.6.4 荧光定量PCR的检测22-23
• 2.6.5 结果判定23-24
• 3 结果与分析24-31
• 3.1 标准曲线的绘制24
• 3.2 特异性试验24-25
• 3.3 重复性试验25
• 3.4 敏感性试验25-26
• 3.5 临床乳样检验26-27
• 3.6 验证试验27-30
• 3.7 标准的建立30-31
• 4 讨论31-34
• 4.1 研究意义31-32
• 4.2 环介导等温扩增技术的应用32
• 4.3 荧光定量PCR与LAMP的应用32-33
• 4.4 展望33-34
• 5 全文总结34-35
• 致谢35-36
• 参考文献36-40
• 附录40-47

【参考文献】

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本文编号：630572