新型的无标记化学发光免疫分析新方法研究

发布时间：2017-09-27 15:29

  本文关键词：新型的无标记化学发光免疫分析新方法研究

  更多相关文章： 无标记 模拟酶 流动注射 化学发光 传感阵列 免疫分析

【摘要】：无标记免疫分析技术能够直接测定生物样品,测定过程中无需预先对抗体或抗原进行标记,具有检测成本低,样品消耗少,耗费时间短,操作简单等显著优势,适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析。而化学发光免疫分析,同时发挥了免疫分析的高特异性和化学发光检测高灵敏的优势,逐渐发展成熟且在免疫分析领域已成为研究热点之一。模拟酶制备简单,性质稳定,不易受外界环境的影响,易修饰和改性,应用方便灵活,且具有较高的催化活性和专一的底物选择性。此外,基于免疫传感阵列而建立起来的空间分辨多组分免疫分析方法可实现更高的检测通量和多样品的同时检测。本论文首次提出了新型的无标记化学发光策略,并围绕该分析策略,通过从天然酶到纳米模拟酶以及从单组分免疫分析到多组分免疫分析的过渡,实现了快速、灵敏、低成本的检测生物分子,具体开展了以下几个方面的研究工作：(1)本文首次提出了一种廉价、快速、简便的无标记化学发光免疫分析新方法。该新型的分析策略通过将捕获抗体和化学发光探针(辣根过氧化酶,HRP)共固定于具有良好生物相容性的金纳米粒子-壳聚糖(AuNPs-Chitosan)的固相复合界面,捕获抗体与抗原的特异性结合将在传感界面形成免疫复合物,该复合物会有效阻碍化学发光底物向HRP界面的扩散,并抑制酶催化的化学发光反应,从而引起化学发光信号的减弱。利用化学发光信号变化和目标抗原浓度的之间的线性关系,可实现快速的无标记化学发光检测。相对传统的标记化学发光免疫分析,该无标记免疫分析方法具有检测成本低,样品消耗少,耗费时间短,操作简单等优势。用人免疫球蛋白(HIgG)作为模型分析物,该分析体系的化学发光信号和HIgG浓度成良好的线性关系,其检测的线性范围为0.10-80 ng/mL,线性相关系数0.9980,检测限为0.068 ng/mL(信噪比为3)。此外,该无标记化学发光免疫传感器具有高的灵敏度、强的特异性、可接受的重现性和实际样品检测的准确性。本文开创性地提出了无标记化学发光免疫分析新思想,将促进化学发光免疫分析技术的革新,对疾病诊断等领域的发展具有重要的意义。(2)本文首次提出了一种基于硫化铜纳米粒子过氧化氢模拟酶(CuSNPs)的无标记化学发光免疫分析方法。该CuSNPs模拟酶通过简单的液相共沉淀方法合成得到,并展现了高效的催化活性和稳定性。该分析策略通过将CuSNPs分散于壳聚糖溶液中,并滴涂于环氧硅烷化的玻璃片表面形成信号层,然后将捕获抗体通过链霉亲和素-生物素系统修饰在信号表面形成传感层。在线温育抗原后,传感界面上的抗体特异性地捕获抗原后形成免疫复合物。该复合物能有效阻碍化学发光底物向信号界面的扩散并抑制模拟酶催化的化学发光反应,引起化学发光强度的减弱。相对于传统的标记免疫分析,该分析方法具有简单、廉价和分析速度快等优点。用甲胎蛋白(AFP)作为模型分析物,该无标记化学发光免疫传感器展现了宽的线性范围(0.10-60 ng/mL),线性相关系数0.9980,检测限为0.066 ng/mL(信噪比为3)。此外,该基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光免疫传感器具有高的特异性和准确性、良好的重现性和稳定性。本文成功发展了一种新型的、可靠的、高效的无标记化学发光免疫分析系统。(3)本文合成了一种高性能氧化铜纳米过氧化氢模拟酶,首次利用其构建了新颖的无标记化学发光免疫分析方法。氧化铜纳米模拟酶改善了传统化学发光免疫分析中天然酶稳定性差、易受环境影响等缺点,显著提高了所构建的化学发光体系的稳定性和灵敏度,并且大大降低了检测费用。该基于纳米模拟酶的无标记化学发光分析策略通过将氧化铜纳米棒分散于壳聚糖溶液并滴涂在环氧硅烷化的玻璃片表面；再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的氧化铜纳米棒表面,封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感器；在线温育抗原后,特异性反应后形成的免疫复合物能有效阻碍化学发光底物向氧化铜纳米模拟酶的扩散并抑制模拟酶催化化学发光,引起化学发光强度的减弱。用癌胚抗原(CEA)作为模型分析物,该无标记化学发光免疫传感器展现了宽的线性范围为0.10-60 ng/mL,线性相关系数0.9981,检测限为0.048 ng/mL(信噪比为3)。该基于氧化铜纳米模拟酶的无标记化学发光免疫分析方法,实现了蛋白快速、廉价、高灵敏检测,在临床诊断中极具前景。(4)本文利用硫化铜纳米模拟酶,发展了一种高灵敏的无标记化学发光成像多组分免疫分析新方法,用于两种肿瘤标志物的同时检测。通过丝网印技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列,并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中。然后将不同生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面,封闭后即制得该无标记化学发光多组分抗体传感阵列。不同的捕获抗体与其目标抗原发生特异性免疫反应,形成的免疫复合物能有效阻碍化学发光底物向硫化铜纳米粒子的扩散并抑制模拟酶催化的化学发光反应,从而引起化学发光信号强度的减弱,由电荷耦合检测器CCD收集该化学发光信号。以甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)作为模型分析物,该无标记免疫传感阵列对AFP和CEA检测的线性范围分别是0.10-70和0.10-60 ng/mL,检测限分别是0.028和0.029 ng/mL(信噪比为3)。该无标记免疫传感器实现了肿瘤标志物廉价、快速、高通量、高灵敏的检测,为临床应用提供了一个有前景的多组分免疫分析方法,具有非常重要的应用价值和实际意义。
【关键词】：无标记 模拟酶 流动注射 化学发光 传感阵列 免疫分析
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-11
• 第一章 前言11-30
• 1.1 免疫分析概述11-15
• 1.1.1 抗原11
• 1.1.2 抗体11
• 1.1.3 免疫分析11-12
• 1.1.4 免疫传感器12-15
• 1.1.4.1 免疫传感器基本原理12-13
• 1.1.4.2 免疫传感器的分类13
• 1.1.4.3 免疫传感器中抗原或抗体的固定方法13-15
• 1.2 化学发光15-17
• 1.2.1 化学发光概述15
• 1.2.2 化学发光分类15-16
• 1.2.3 化学发光常用体系16-17
• 1.2.4 化学发光的应用和发展17
• 1.3 化学发光免疫分析17-19
• 1.3.1 化学发光免疫分析的基本原理17-18
• 1.3.2 无标记化学发光免疫分析技术的发展18
• 1.3.3 化学发光免疫分析与其它技术的结合18-19
• 1.4 纳米材料19-20
• 1.4.1 纳米材料的定义19
• 1.4.2 纳米材料的特性19
• 1.4.3 纳米材料在免疫传感器中的应用19-20
• 1.5 多组分免疫分析20-23
• 1.5.1 时间分辨多组分免疫分析20
• 1.5.2 空间分辨多组分免疫分析20-23
• 1.5.2.1 阵列检测器21
• 1.5.2.2 空间分辨多组分免疫分析21-22
• 1.5.2.3 空间分辨多组分免疫分析的发展22-23
• 1.5.3 其它模式多组分免疫分析23
• 1.6 肿瘤标志物23-24
• 1.7 本文的主要研究工作24
• 1.8 参考文献24-30
• 第二章 基于共固定捕获抗体和天然酶策略的无标记化学发光免疫分析新方法30-44
• 2.1 实验部分31-34
• 2.1.1 试剂与材料31
• 2.1.2 仪器31-32
• 2.1.3 纳米金的合成32-33
• 2.1.4 免疫传感器的制备33
• 2.1.5 免疫分析步骤33-34
• 2.2 结果与讨论34-40
• 2.2.1 无标记化学发光免疫分析方法可行性的验证34-35
• 2.2.2 免疫传感器的表征35-37
• 2.2.2.1 免疫传感器的SEM表征35-36
• 2.2.2.2 免疫传感器的阻抗表征36-37
• 2.2.2.3 免疫传感器的接触角表征37
• 2.2.3 免疫分析过程的优化37-38
• 2.2.3.1 化学发光反应动力学特征37-38
• 2.2.3.2 温育时间的优化38
• 2.2.4 特异性研究38-39
• 2.2.5 免疫传感器的重现性和稳定性39
• 2.2.6 分析性能和临床样品的检测39-40
• 2.3 结论40-41
• 2.4 参考文献41-44
• 第三章 基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光免疫分析新方法检测甲胎蛋白44-58
• 3.1 实验部分45-47
• 3.1.1 试剂与材料45
• 3.1.2 仪器45-46
• 3.1.3 硫化铜纳米粒子的合成46
• 3.1.4 免疫传感器的制备46
• 3.1.5 免疫分析步骤46-47
• 3.2 结果与讨论47-55
• 3.2.1 无标记化学发光免疫分析方法可行性的验证47-48
• 3.2.2 硫化铜纳米粒子的表征48-49
• 3.2.3 免疫传感器的表征49-52
• 3.2.3.1 免疫传感器的SEM表征49-50
• 3.2.3.2 免疫传感器的XPS和FT-IR表征50
• 3.2.3.3 免疫传感器的阻抗表征50-51
• 3.2.3.4 免疫传感器的接触角表征51-52
• 3.2.4 免疫分析过程的优化52-53
• 3.2.4.1 化学发光反应动力学特征52
• 3.2.4.2 温育时间的优化52-53
• 3.2.5 特异性研究53-54
• 3.2.6 免疫传感器的重现性和稳定性54
• 3.2.7 分析性能和临床样品的检测54-55
• 3.3 结论55-56
• 3.4 参考文献56-58
• 第四章 基于氧化铜纳米模拟酶的无标记化学发光免疫分析新方法检测癌胚抗原58-73
• 4.1 实验部分59-62
• 4.1.1 试剂与材料59
• 4.1.2 仪器59-60
• 4.1.3 氧化铜纳米棒的合成60
• 4.1.4 免疫传感器的制备60
• 4.1.5 免疫分析步骤60-62
• 4.2 结果与讨论62-71
• 4.2.1 无标记化学发光免疫分析方法可行性的验证62
• 4.2.2 氧化铜纳米棒的表征62-63
• 4.2.3 氧化铜纳米棒模拟酶性质63-64
• 4.2.4 免疫传感器的表征64-67
• 4.2.4.1 免疫传感器的SEM表征64-65
• 4.2.4.2 免疫传感器的阻抗表征65-66
• 4.2.4.3 免疫传感器的接触角表征66
• 4.2.4.4 免疫传感器的红外表征66-67
• 4.2.5 免疫分析过程的优化67-68
• 4.2.5.1 化学发光反应动力学特征67-68
• 4.2.5.2 温育时间的优化68
• 4.2.6 特异性研究68-69
• 4.2.7 免疫传感器的重现性和稳定性69-70
• 4.2.8 分析性能和临床样品的检测70-71
• 4.3 结论71
• 4.4 参考文献71-73
• 第五章 多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫分析新方法73-86
• 5.1 实验部分74-76
• 5.1.1 试剂与材料74
• 5.1.2 仪器74-75
• 5.1.3 硫化铜纳米粒子的合成75
• 5.1.4 免疫传感阵列的构建75
• 5.1.5 免疫分析步骤75-76
• 5.2 结果与讨论76-83
• 5.2.1 无标记化学发光免疫分析方法可行性的验证76-77
• 5.2.2 免疫传感器的表征77-79
• 5.2.2.1 免疫传感器的化学发光表征77-78
• 5.2.2.2 免疫传感器的CV表征78-79
• 5.2.2.3 免疫传感器的接触角表征79
• 5.2.3 免疫分析过程的优化79-81
• 5.2.3.1 化学发光反应动力学特征79-80
• 5.2.3.2 温育时间的优化80-81
• 5.2.4 特异性研究81
• 5.2.5 免疫传感器的重现性和稳定性81-82
• 5.2.6 分析性能和临床样品的检测82-83
• 5.3 结论83-84
• 5.4 参考文献84-86
• 攻读硕士研究生期间发表及待发表的论文86-87
• 致谢87-88

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本文编号：930482