布鲁氏菌免疫磁珠及免疫荧光检测方法的研究

发布时间：2017-10-07 13:16

  本文关键词：布鲁氏菌免疫磁珠及免疫荧光检测方法的研究

  更多相关文章： 布鲁氏菌 BCSP31 表面蛋白 克隆表达 免疫荧光 免疫磁珠

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)感染引起的重要的人兽共患传染病之一,属于二类传染病。上世纪80年代以来,随着我国畜牧业迅猛蓬勃发展,使我国家畜布鲁氏菌病的流行以及对人的危害有所加重。近些年,布鲁氏菌病的大规模爆发极少,以小范围爆发为主,较分散,这给防治工作带来较大困难。布鲁氏菌病严重威胁人类的健康,同时影响着乳品、肉类等畜牧产业,给动物性食品安全和公共卫生安全带来很大的挑战。传统检测动物源性食品中布鲁氏菌程序复杂,耗时耗力,免疫磁性分离技术是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术,可以有效收集、浓缩大量样品中的少量病原微生物,对目的菌分离具有高分离率、高特异性、操作简单、不需要昂贵的仪器设备等特点。因此本研究拟建立布鲁氏菌免疫磁性分离技术,并研究其在动物源性食品检测中的应用。本研究利用PCR方法从羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌株基因组中扩增到表面蛋白基因bcsp31,克隆至载体pJET1.2,然后亚克隆至原核表达载体pET28a,构建出重组表达质粒pET28a-bcsp31,并将其转化至表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,表达出了31kDa的重组蛋白。重组BCSP31蛋白呈可溶性表达,表达量约占细菌可溶性蛋白46.3%。通过Ni-NTA亲和层析纯化了重组蛋白,纯化后的蛋白纯度约为94.7%。对BCSP31蛋白的免疫原性实验结果表明,重组蛋白免疫小鼠血清抗体效价可达1:16 000以上,重组蛋白免疫小鼠血清与布鲁氏菌呈均阳性反应,说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。用重组蛋白BCSP31和羊种布鲁氏菌疫苗株M5分别免疫家兔,获得布鲁氏菌多克隆抗体,制备免疫磁珠,并对制备条件进行优化,最终确定磁珠活化时间45 min,最佳抗体体积500μL,最佳偶联时间14 h,最佳磁珠用量20μL,最佳富集时间30 min,最佳洗涤液pH值7.4。分别用蛋白免疫抗体和羊布鲁氏菌M5免疫抗体包被磁珠,对10~109 CFU/mL的9个浓度梯度的羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液进行捕获,涂TSB平板,37℃培养5 d后挑取疑似菌落进行PCR鉴定,结果显示蛋白免疫抗体包被磁珠的检测限为104 CFU/m L,菌体免疫抗体包被磁珠的检测限为10 CFU/mL,说明布鲁氏菌菌体免疫抗体包被磁珠效果好于重组蛋白免疫抗体包被磁珠。用免疫磁珠对牛种布鲁氏菌弱毒株45/20、猪种布鲁氏菌疫苗株S2菌液进行捕获,结果显示免疫磁珠对不同种的布鲁氏菌均可检测。用羊种布鲁氏菌疫苗株M5对牛奶和肉类样品进行人工模拟污染后,用免疫磁珠集菌后进行涂板培养,结果显示对污染样品的检测限为103CFU/mL,而直接用PCR进行检测的下限为104 CFU/m L,说明免疫磁珠结合平板培养的方法,不仅检测敏感性高于PCR方法,还可以直接分离到污染样品中的布鲁氏菌。本研究还利用获得的布鲁氏菌多克隆抗体建立了布鲁氏菌间接免疫荧光检测技术,最终确定一抗二抗稀释倍数均为1:40,对不同浓度的羊种布鲁氏菌疫苗株M5菌液进行间接免疫荧光实验,在荧光显微镜下观察,最低可在105 CFU/mL浓度的菌液中观察到呈特异性荧光的布鲁氏菌菌体,还可在2 h内完成动物脏器中布鲁氏菌的检测。综合研究结果表明,成功表达了布鲁氏菌BCSP31重组蛋白,该重组蛋白具有良好的免疫原性,以重组蛋白和布鲁氏菌菌体包被ELISA板,与免疫小鼠血清均呈阳性反应。用免疫抗体包被磁珠,建立了布鲁氏菌免疫磁珠检测方法,不仅检测敏感性提高,还可分离样品中的布鲁氏菌。间接免疫荧光法可以快速排查布鲁氏菌,大大节省实验时间,若将两种方法结合起来,则能更有效的检测样品中的布鲁氏菌,为市场检疫提供更为便捷的检验方法,对于重大卫生事件爆发的应急检测,也有着重大意义。
【关键词】：布鲁氏菌 BCSP31 表面蛋白 克隆表达 免疫荧光 免疫磁珠
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS207.4;O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-18
• 1.1 布鲁氏菌9
• 1.2 布鲁氏菌病9-10
• 1.3 布鲁氏菌病的流行现状10
• 1.4 布鲁氏菌检测方法10-13
• 1.5 布鲁氏菌外膜蛋白研究进展13-14
• 1.6 免疫磁性分离技术14-15
• 1.7 研究目的与意义15-16
• 1.8 研究创新点16
• 1.9 研究内容16-18
• 2 材料与方法18-35
• 2.1 材料18-20
• 2.2 方法20-35
• 3 结果与分析35-47
• 3.1 重组表达质粒pET28a-bcsp31的构建35-36
• 3.2 重组蛋白BCSP31的表达与纯化36-38
• 3.3 重组蛋白BCSP31免疫原性研究38-40
• 3.4 布鲁氏菌间接免疫荧光检测技术的建立40-43
• 3.5 布鲁氏菌免疫磁性分离技术的建立43-45
• 3.6 免疫磁珠检测模拟污染样品中的布鲁氏菌45-47
• 4 讨论47-49
• 4.1 布鲁氏菌bcsp31基因的克隆表达47
• 4.2 布鲁氏菌BCSP31蛋白的免疫原性研究47
• 4.3 布鲁氏菌间接免疫荧光检测技术的建立47-48
• 4.4 布鲁氏菌免疫磁性分离技术的建立48-49
• 5 结论49-50
• 5.1 成功表达出布鲁氏菌表面蛋白BCSP3149
• 5.2 表达的重组蛋白BCSP31具有良好的免疫原性49
• 5.3 建立了布鲁氏菌间接免疫荧光检测技术49
• 5.4 建立了布鲁氏菌免疫磁性分离技术49-50
• 参考文献50-56
• 作者简介56-57
• 致谢57

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本文编号：988053