牛Myf6基因克隆及在成肌细胞中的表达

发布时间：2016-08-25 00:21

  本文关键词：动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

《东北农业大学》 2010年

牛Myf6基因克隆及在成肌细胞中的表达

汤展毅  

【摘要】： 随着人们膳食结构的不断变化及对健康的日益关注,牛肉品质受到了前所未有的重视,优质、高档牛肉供不应求。生肌家族控制着整个肌肉的发育过程,从前体肌细胞的定型、增殖以及肌纤维的形成,直到个体出生后的成熟和功能的完善,都有生肌调节因子的参与,直接影响着动物的产肉能力与肌肉品质。Myf6是生肌家族中的一员,通过深入研究myf6基因对肌肉发育的调控机制,实现对myf6基因的调控,就能够改变肌肉形成过程中肌纤维的性状,从而提高牛肉品质。 本实验应用PCR方法扩增myf6基因片段,在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6。脂质体技术转染鲁西黄牛成纤维细胞和成肌细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株。利用western blot、Real-time PCR技术检测细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量变化。 本实验初步建立了脂质体法转染myf6转基因技术,确定了G418对成纤维细胞的最小致死浓度为400μg/ml,对成肌细胞的最小致死浓度为600μg/ml,两种细胞筛选均获得了稳定转染的细胞株。转染后的成纤维细胞和成肌细胞中myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P0.01),肌肉肌酸激酶基因mRNA表达量升高(P0.01),肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量也提高(P0.01)。细胞形态观察显示转染后的成纤维细胞没有形态变化,未融合为肌管。转染后的成肌细胞融合为肌管。表明构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成纤维细胞和成肌细胞中高效表达,并且myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。 本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体,使myf6基因在鲁西黄牛成纤维细胞和成肌细胞中表达,建立myf6基因转染细胞的技术基础。获得了myf6基因对两种细胞的分化影响的数据。本研究得到的稳定转染myf6基因的细胞株为下一步进行转myf6基因肉牛体细胞克隆提供了重要的实验材料。

【关键词】：
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S823;Q78
【目录】：

摘要8-9

Abstract9-10

1 引言10-21

1.1 MRF 家族的发现与重要意义10

1.2 MRF 家族成员10-13

1.2.1 MyoD 基因10-11

1.2.2 Myf5 基因11-12

1.2.3 MyoG 基因12-13

1.3 Myf6 基因研究13-15

1.3.1 Myf6 基因的分子结构13

1.3.2 Myf6 基因的功能13-14

1.3.3 myf6 基因在分化中的作用14

1.3.4 Myf6 基因的定位14-15

1.3.5 不同物种中Myf6 基因15

1.4 Myf6 基因应用前景及展望15-17

1.4.1 在遗传育种方面的应用15-16

1.4.2 在肌肉的再生方面的应用16

1.4.3 在疾病治疗方面的应用16-17

1.5 转基因牛的研究17-19

1.5.1 动物转基因技术主要方法17-18

1.5.2 转基因牛的研究18

1.5.3 转基因牛的应用18-19

1.6 研究的目的和意义19-21

2 材料与方法21-33

2.1 实验材料21-22

2.1.1 主要实验仪器21

2.1.2 主要实验材料与试剂21-22

2.2 试验方法22-33

2.2.1 Myf6 基因的克隆与测序22-26

2.2.2 真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6 的构建26-28

2.2.3 牛成肌细胞的培养和鉴定28

2.2.4 重组质粒pIRES2-EGFP-myf6 表达载体瞬时转染牛成纤维细胞和成肌细胞28-29

2.2.5 成纤维细胞和成肌细胞最小致死量测定29

2.2.6 重组质粒pIRES2-EGFP-myf6 表达载体稳定转染牛成纤维细胞和成肌细胞29

2.2.7 转染细胞的显微镜检测29

2.2.8 Western Blot 检测myf6 基因蛋白表达29-30

2.2.9 Real time PCR 检测相关基因表达30-33

3 结果与分析33-45

3.1 Myf6 基因的PCR 扩增33

3.2 阳性重组子pMD18-M 的双酶切鉴定33-34

3.3 Myf6 基因的序列测定34

3.4 真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6 的双酶切鉴定34-35

3.5 成肌细胞的鉴定35-36

3.6 转染细胞的荧光检测36-38

3.6.1 转染细胞的荧光检测36-37

3.6.2 稳定转染后细胞形态观察37-38

3.7 G418 对牛皮肤成纤维细胞最小致死量的确定38

3.8 Western Blot 检测myf6 基因蛋白表达38-40

3.8.1 Western Blot 检测转染后成纤维细胞中myf6 基因的蛋白表达38-39

3.8.2 Western Blot 检测转染后成肌细胞中myf6 基因的蛋白表达39-40

3.9 实时荧光RT-PCR 检测相关基因表达40-45

3.9.1 RT-PCR 检测成纤维细胞相关基因的表达40-42

3.9.2 RT-PCR 检测转染后成肌细胞相关基因的表达42-45

4 讨论45-50

4.1 Myf6 基因获得和真核表达载体的构建45-46

4.1.1 Myf6 基因获得45

4.1.2 真核表达载体构建45-46

4.2 Myf6 基因转染成纤维细胞46-47

4.2.1 转染方法的选择46

4.2.2 转染条件的选择46-47

4.2.3 Myf6 基因对成纤维细胞的影响47

4.3 Myf6 基因转染成肌细胞47-50

4.3.1 成肌细胞的鉴定47

4.3.2 G418 筛选稳定转染细胞47-48

4.3.3 荧光定量PCR 技术48

4.3.4 Myf6 基因对成肌细胞的影响48-50

5 结论50-51

致谢51-52

参考文献52-56

攻读硕士学位期间发表的学术论文56

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1 韩颖;孔庆然;尹智;魏延昌;张鑫淼;汪亦男;刘忠华;;牛肌源性干细胞的培养和鉴定[J];东北农业大学学报;2008年12期

2 朱砺,李学伟;Myf-6基因在不同猪种中的PCR-RFLP遗传多态性及其遗传效应分析[J];遗传;2005年06期

3 孙文浩;朱庆;蒋小松;杜华锐;;鸡Myf6基因遗传多态性及其遗传效应研究[J];遗传;2008年01期

4 郑月茂;赵雪;贺小英;权富生;刘军;张涌;;转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化[J];中国农业科学;2009年09期

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1 郑学项;冯素萍;李维国;;DNA分子标记研究进展[J];安徽农业科学;2009年26期

2 杨慧婷;王洪梅;孙涛;高运东;仲跻峰;何洪彬;;动物转基因研究进展[J];现代农业科技;2011年02期

3 黄永震;贺花;陈宏;;动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用[J];中国牛业科学;2011年04期

4 马雪莹;杨巍;刘宁;;牛乳骨桥蛋白诱导破骨细胞γ-H2AX焦点的形成[J];东北农业大学学报;2012年02期

5 李昌庆;苏瑛;;转基因技术在动物育种中的研究进展[J];广东农业科学;2010年04期

6 崔文涛;;转基因牛研究进展[J];中国畜牧兽医;2007年07期

7 弓俊红;晋大鹏;;转基因技术在家畜研究上的应用[J];国外畜牧学(猪与禽);2009年04期

8 朱春红;宋迟;陶志云;宋卫涛;胡艳;束婧婷;陈文峰;李慧芳;;鸭胚骨骼肌不同组织Myf6基因表达的发育性变化研究[J];中国畜牧兽医;2013年02期

9 段芳;兰志刚;李卫娟;;动物遗传育种研究进展[J];黑龙江动物繁殖;2011年04期

10 周丹;安玲;马艳娇;李鹏;;转基因动物的研究进展及其在畜牧业上的应用[J];现代畜牧兽医;2010年07期

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1 朱砺;李学伟;李芳琼;李明洲;陈磊;;Myf-6基因对肌肉中氨基酸组成的遗传效应分析[A];第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2006年

2 陆敏;许黎明;黄青山;;重组溶葡萄球菌酶在鲜牛奶中的稳定性分析[A];首届中国兽药大会动物药品学暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008学术年会论文集[C];2008年

3 汪亦男;丛义梅;张鑫淼;胡魁;刘忠华;;猪神经干细胞分离培养研究进展[A];第十届中国实验动物科学年会论文集[C];2012年

4 朱春红;陶志云;宋卫涛;胡艳;章双杰;李慧芳;;金定鸭胚胎期骨骼肌发育及肌分化因子MyoD1基因发育性表达分析[A];第五届（2013）中国水禽发展大会会刊[C];2013年

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1 李江南;RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究[D];吉林大学;2011年

2 吴琼;中国环颈雉屠宰和肉质性状相关候选基因研究[D];中国农业科学院;2011年

3 张东;转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D];内蒙古农业大学;2011年

4 庞永红;黄牛VEGF、VEGF-B、Flt-1基因遗传变异、克隆与表达研究[D];西北农林科技大学;2011年

5 崔奎青;转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究[D];广西大学;2007年

6 彭树英;TGEV S基因的克隆、表达及转基因小鼠的制备[D];西北农林科技大学;2007年

7 束婧婷;鸡肌苷酸相关候选基因遗传效应及表达规律研究[D];扬州大学;2008年

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3 汪亦男;猪成体神经干细胞分离、培养的研究[D];东北农业大学;2011年

4 李全芬;转基因牛基因芯片检测方法的建立[D];南京师范大学;2011年

5 郭亮;基于多基因谱系的中国南方地区松乳菇群体遗传多样性研究[D];中南林业科技大学;2011年

6 孙克宁;利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究[D];河南农业大学;2011年

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9 任斌;猪AMPD1、MYF6基因的多态性及其与部分经济性状相关性研究[D];湖南农业大学;2008年

10 彭巍;HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达[D];西北农林科技大学;2009年

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1 赵慧英,张涌;神经干细胞定向诱导分化条件研究[J];安徽农业大学学报;2005年03期

2 耿嘉瑄;孙莹璞;;胚胎干细胞转录因子Nanog研究进展[J];国外医学(计划生育/生殖健康分册);2006年06期

3 马国涛,任华,赵明,张超纪,裴铭;骨髓间质干细胞体外转分化为肌细胞的实验研究[J];基础医学与临床;2005年01期

4 王勇;陆长青;王凡;;丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化[J];解剖学杂志;2007年02期

5 陈大元,李劲松,韩之明,雷蕾,刘忠华,寇朝辉,马世援,杜启科,孙青原;体细胞克隆牛:供体细胞和受体的影响[J];科学通报;2003年08期

6 姜运良,李宁,吴常信;肌肉生成的分子生物学研究进展(综述)[J];农业生物技术学报;1999年02期

7 李庆国,梁鹏,武俏丽,林志国,刘恩重,戴钦舜;人胚中脑神经干细胞的分离、增殖及分化的研究[J];中华神经外科疾病研究杂志;2002年02期

8 杨立业,惠国桢,包大士,蒋丽珍,费俭,郭礼和;神经干细胞体外长期培养和外源基因表达[J];中华神经外科疾病研究杂志;2002年03期

9 陈艳玫,姚錱;转录因子Sox2的研究进展[J];生命科学;2004年03期

10 李东伟;李文雍;;转录因子0ct4、Sox2和Nanog在早期胚胎发育过程中的表达调控[J];生物学杂志;2007年03期

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1 金人一;;注射成肌细胞对肌肉营养障碍治疗可能是个突破[J];生物技术通报;1989年10期

2 罗钧秋;陈代文;;肌肉生长抑制素(MSTN)对肌肉调控的分子作用机制[J];黑龙江畜牧兽医;2007年07期

3 李思经;;帕金森病的新疗法:rDNA肌细胞[J];生物技术通报;1993年11期

4 叶巧真 ,卢爱平 ,张景强;意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)飞翔肌的发育[J];中山大学学报论丛;1995年02期

5 吴丹;胡兰;;MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖及分化的影响[J];沈阳农业大学学报;2009年01期

6 文旭辉;罗桂芬;孙世铎;杨公社;;Leptin对猪成肌细胞中PGC-1α和UCPs mRNA表达的影响[J];农业生物技术学报;2007年04期

7 汤展毅;严云勤;高学军;陆黎敏;朱丹丹;冀志庚;;牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达[J];中国农业科学;2010年13期

8 葛昕;李亚明;窦忠英;;外源性rhCNTF抑制成人成肌细胞体外分化作用及其信号机制[J];西北农业学报;2010年09期

9 朱丹丹;高学军;严云勤;刘晓飞;陆黎敏;;牛骨骼肌特异性启动子的筛选[J];中国畜牧兽医;2011年03期

10 杨晓宇;郝文博;董顺义;谷文峰;杨剑杰;胡兰;;Follistatin Related-gene在小鼠成肌细胞中表达的研究[J];沈阳农业大学学报;2008年02期

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1 魏晓静;倪迎冬;;雌马酚对双氧水诱导鸡成肌细胞损伤的保护作用及机理研究[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

2 王奎鹏;冯国清;胡香杰;;巴戟天寡糖对成肌细胞增殖及分化的影响[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年

3 夏维波;中山耕之介;福本诚二;竹内靖博;藤田敏郎;;SIPI(Smad interacting protein)-1的表达及其在BMP信号转导和成肌细胞分化中的作用[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年

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5 吴瑶;冯国清;胡香杰;;巴戟天寡糖对成肌细胞增殖及向心肌样细胞分化的影响[A];全国第十一届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2009年

6 冯阳;曹建华;李新云;赵书红;;miR-145在猪骨骼肌发育和成肌细胞分化不同时期的差异表达分析[A];中国遗传学会模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2010年

7 冯阳;曹建华;李新云;赵书红;;miR-145在猪骨骼肌发育和成肌细胞分化不同时期的差异表达分析[A];中国遗传学会模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2010年

8 李惠英;周红雨;连志云;刘立斌;罗丽;张伶君;刘举;赵代弟;;Micro-dystrophin基因转染C57/BL10小鼠成肌细胞的实验研究[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

9 阮红峰;徐世文;;硒对鸡成肌细胞硒蛋白W mRNA表达的影响[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)[C];2010年

10 冯国清;王奎鹏;于爽;胡香杰;;巴戟天寡糖对成肌细胞增殖及分化的影响[A];第十届全国生化与分子药理学术会议论文摘要汇编[C];2007年

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1 董映璧;[N];科技日报;2005年

2 刘 向;[N];中国中医药报;2004年

3 记者 田学科;[N];科技日报;2007年

4 香港麦迪信医学出版有限公司供稿;[N];医药经济报;2002年

5 毛天球;[N];中国医药报;2000年

6 张孟军;[N];科技日报;2004年

7 葛秋芳;[N];新华每日电讯;2006年

8 记者 陈威华;[N];新华每日电讯;2002年

9 徐述湘;[N];中国医药报;2004年

10 记者 范建;[N];科技日报;2002年

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1 丁可;基因修饰成肌细胞结合可注射温敏凝胶支架构建组织工程骨的实验研究[D];第三军医大学;2013年

2 曲江波;载脂蛋白J对诱导成肌细胞中CXCR4表达和迁移及潜在保护作用机制的研究[D];山东大学;2010年

3 白雪;旋毛虫排泄分泌物调节巨噬细胞及成肌细胞功能的体外研究[D];吉林大学;2011年

4 张力;骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化及引导性骨再生的研究[D];辽宁中医药大学;2012年

5 唐浩;转基因成肌细胞治疗慢性心肌梗死实验研究—体外实验部分[D];中南大学;2003年

6 李任;携带自分泌运动因子基因的成肌细胞自体移植促进神经肌肉功能恢复[D];重庆医科大学;2012年

7 谭家莉;应力条件下成肌细胞增殖、分化和凋亡的调控及其分子机制的探讨[D];第四军医大学;2010年

8 邓小玲;AFP DNA疫苗治疗肝癌的实验研究[D];四川大学;2003年

9 刘传康;糖皮质激素局部注射治疗婴幼儿先天性斜颈机理的研究[D];重庆医科大学;2003年

10 孙天威;组织工程化肌及成肌细胞移植的实验研究[D];四川大学;2005年

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1 孙仙蕊;线粒体通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其调控机制[D];青岛大学;2013年

2 吴琼;硒对鸡成肌细胞分化及骨骼肌炎症基因表达影响的研究[D];东北农业大学;2013年

3 李晓艳;光、电刺激对成肌细胞生长增殖影响的实验研究[D];重庆大学;2013年

4 徐文进;软骨源性形态发生蛋白2基因转染小鼠成肌细胞表达软骨细胞表型的实验研究[D];辽宁医学院;2011年

5 程亮;成肌细胞移植治疗缺血性心肌病机理的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

6 翟克敏;过氧化氢调节成肌细胞线粒体移动的初步研究[D];天津体育学院;2010年

7 李松;骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化及大鼠间异体移植的研究[D];河北医科大学;2012年

8 李菲菲;p38MAPK信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用[D];山东大学;2012年

9 安静;IGF1在绵羊成肌细胞增殖与分化中的作用[D];新疆农业大学;2013年

10 高铭鞠;FAD24对小鼠成肌细胞增殖和分化的调节作用[D];华中农业大学;2013年

  本文关键词：动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：102515