RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除及其功能初探

发布时间：2024-07-02 21:54

　　RNA甲基化作为一种表观遗传标记,在基因调控中发挥着重要作用。至今为止,已发现RNA存在着100多种修饰,其中甲基化是主要的修饰形式,6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)是最具有代表性的两种甲基化修饰。有研究表明RNAm5C修饰在生物体的发育以及癌症的发生中起重要作用。最初被认为是DNA甲基转移酶的TRDMT1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1)近十年来被证实是RNA m5C甲基转移酶,催化tRNA产生5-甲基胞嘧啶修饰。最近有研究发现TRDMT1基因对器官形成、生物体的发育以及疾病的发生有影响。然而,对TRDMT1调控这些过程的分子机制尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9诱导的同源重组技术在RNA甲基化酶TRDMT1基因的转录起始位点上敲入转录终止序列BGH ploy(A),终止TRDMT1的表达从而达到敲除的目的。通过构建TRDMT1敲除的HEK293细胞系,研究TRDMT1去表达对细胞表型以及其他基因表达的影响,从而了解TRDMT1基因的功能,为研究RNAm5C甲基化的功能提供新思路。主要的研究方法与结果如下:1、建...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－１?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９系统的作用原理（引用）??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ??

被改编为一个基因编辑工具，改造后的系统包含两部分：向导ＲＮＡ?（ｓｉｎｇｌｅ?ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，??ｓｇＲＮＡ）和Ｃａｓ９蛋白。ｓｇＲＮＡ是人工合成的一段能够识别目标序列的ＲＮＡ序列，其中包??含招募Ｃａｓ９蛋白的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ复合体的发夹结构。作用原理如图１－１....

图２－１?ｇＲＮＡ和检测引物位置示意图??．－

２．２．１获得同源重组片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ??利用ＰＣＲ的方法在Ｐｕｒｏ－ＢＧＨ?ｐｏｌｙ?（Ａ）片段５’端添加Ｔ２Ａ和ＬＯＸＮ序列，构建同源??重组片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ?（图２－２）。以ｐＳＭＰＵＷ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ载体为模板，使用高保真酶（Ｐｈａｎｔａ？??Ｓｕｐｅｒ－....

图2-2LC)RN-Pwo结构以及PCR引物位置示意图

图２－１?ｇＲＮＡ和检测引物位置示意图??Ｆｉｇ．２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｇＲＮＡ?ａｎｄ?ｐｒｉｍｅｒ?ｐｏｓｉｔｉｏｎ??２．２构建ＴＲＤＭＴｌ－ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ同源重组载体??２．２．１获得同源重组片段ＬＯＸＮ－Ｐｕｒｏ??利用ＰＣＲ的方法在Ｐｕ....

图２－３?ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ结构以及ＰＣＲ引物位置示意图??

?２．２．２扩增左端同源臂ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ??利用引物扩增靶位点左端同源臂ＴＲＤＭＴ１－ＬＲ?（图２－３）。具体实验方法如下：??（１）

本文编号：4000069