基于几丁质合成酶基因调控的黑曲霉发酵形态优化

发布时间：2017-10-15 03:22

  本文关键词：基于几丁质合成酶基因调控的黑曲霉发酵形态优化

  更多相关文章： 黑曲霉 柠檬酸 RNA干扰 几丁质合成酶 形态

【摘要】：柠檬酸是一种广泛应用于食品、医药、化妆品和化工行业中的重要有机酸。黑曲霉(Aspergillus niger)是柠檬酸发酵工业的主要菌种,作为一种常见的丝状真菌,在深层发酵过程中,菌丝体的形态对柠檬酸的合成代谢有重要的影响。在工业生产中,可以通过调控形态基因的表达,对菌丝体的形态进行优化,进而提高柠檬酸的产量和产率。本文主要研究黑曲霉的几丁质合成酶基因chsC的调控在优化发酵形态和柠檬酸产量中的应用。本文选择干扰载体pJL43-RNAi作为chsC基因沉默的质粒载体。首先将NcoI酶切得到的chsC基因片段与质粒pJL43-RNAi连接,构建干扰载体pchsC-RNAi.为提高干扰载体的转化率,对原生质体制备、再生和转化的条件进行了优化。优化的结果表明：在36.5℃培养16h的幼嫩菌丝最利于原生质体释放；最优的酶组合是5 mg/mL的溶菌酶,10 mg/mL的蜗牛酶和10 mg/mL的纤维素酶组成的混合酶系；在酶解温度为30℃,以100r/min酶解3h可使原生质体的最大产量达到5.11×106/mL；最优的再生培养基为完全培养基,可以使再生率达到36.97%。然后通过聚乙二醇(PEG)的介导将干扰载体pchsC-RNAi导入黑曲霉原生质体中,筛选得到7株转化菌。通过反转录PCR和实时荧光定量PCR检测,发现转化株的chsC基因发生不同程度的沉默；同时细胞壁的几丁质含量也与chsC基因的表达量呈正相关,RNAi的效果越显著,chsC基因的表达量越低,相应的细胞壁几丁质含量也越低。转化菌株的柠檬酸产量与原始菌株相比均有所提高,其中chsC-3和chsC-5的产酸量提高尤为显著,分别提高了42.57%和36.73%。而干扰效果较明显的chsC-7的产酸增幅反而不明显,仅比原始菌株增长0.37%,由此推断,chsC的表达量维持在一定水平对柠檬酸的积累有重要作用。通过显微镜观察深层发酵的菌丝体形态,发现转化菌株的菌丝分支频率降低,菌丝分支缩短,离散菌丝减少,与原始菌株相比,发酵液的粘度降低,进而提高了物质和氧气在发酵液中的传递效率,更有利于柠檬酸的积累。通过单因素实验法对高产菌株chsC-3在摇瓶水平的装液量、接种量、转速和培养温度等因素进行优化,优化的结果是：装液量为500 mL三角瓶装60 mL培养基,接种量为5×104/mL,转速为300 r/min,培养温度为37℃。以优化得到的最佳培养条件分别对CK和chsC-3菌株进行发酵培养,柠檬酸产量较优化前均有所提高,发酵至72 h的产酸分别提高了7.32%和21.74%。两株菌株的发酵周期均在108 h左右,发酵结束后菌株chsC-3比菌株CK的柠檬酸产量提高5.35%。菌株CK和chsC-3的在5L种子罐和30 L发酵罐上进行深层发酵培养,高产菌株chsC-3和原始菌株CK相比,菌球的分支频率降低,菌丝的分支缩短,柠檬酸产量提高3.21%,糖酸转化率提高3.20%,发酵周期缩短1 h。高产菌株chsC-3在工艺放大的过程中,表现出较好的生产潜力。
【关键词】：黑曲霉 柠檬酸 RNA干扰 几丁质合成酶 形态
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ920.6;Q78
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 绪论10-24
• 1.1 柠檬酸简介10-12
• 1.1.1 柠檬酸的性质10-11
• 1.1.2 柠檬酸的作用11-12
• 1.2 黑曲霉发酵生产柠檬酸12-16
• 1.2.1 黑曲霉生物合成柠檬酸的途径12-13
• 1.2.2 黑曲霉发酵生产柠檬酸的研究现状13-16
• 1.3 丝状真菌的形态控制16-21
• 1.3.1 概述16-17
• 1.3.2 培养环境17-19
• 1.3.3 形态基因19-20
• 1.3.4 RNA干扰(RNAi)在丝状真菌中的应用20-21
• 1.4 本论文研究的背景与内容21-24
• 第二章 几丁质合成酶基因的扩增与干扰载体的构建24-33
• 2.1 材料与方法24-29
• 2.1.1 材料24-27
• 2.1.2 方法27-29
• 2.2 结果与分析29-32
• 2.2.1 目的几丁质合成酶基因的确定29-30
• 2.2.2 chsC基因片段的扩增30
• 2.2.3 质粒载体的提取和酶切30-31
• 2.2.4 干扰载体的构建31-32
• 2.3 小结32-33
• 第三章 原生质体的制备、再生和转化体系的构建33-43
• 3.1 材料与方法33-37
• 3.1.1 材料33-35
• 3.1.2 方法35-37
• 3.2 结果与分析37-42
• 3.2.1 不同酶组合对原生质体形成的影响37-38
• 3.2.2 不同菌龄和酶解条件对原生质体形成的影响38-39
• 3.2.3 酶解时间对原生质体制备和再生的影响39-40
• 3.2.4 不同种类再生培养基对原生质体再生的影响40-41
• 3.2.5 原生质体形成过程的形态观察41
• 3.2.6 转化菌株的菌落形态观察41-42
• 3.3 小结42-43
• 第四章 chsC基因沉默对深层发酵过程中菌丝体形态和柠檬酸产量的影响43-56
• 4.1 材料与方法43-50
• 4.1.1 材料43-45
• 4.1.2 方法45-50
• 4.2 结果与分析50-54
• 4.2.1 chsC基因沉默程度检测50-51
• 4.2.2 chsC基因沉默对细胞壁几丁质含量的影响51-53
• 4.2.3 chsC基因对菌株的柠檬酸产量的影响53
• 4.2.4 菌株深层发酵的菌丝体形态观察53-54
• 4.3 小结54-56
• 第五章 柠檬酸高产菌株chsC-3发酵工艺优化的初步探究56-67
• 5.1 材料与方法56-59
• 5.1.1 材料56-57
• 5.1.2 方法57-59
• 5.2 结果与分析59-66
• 5.2.1 不同装液量对产柠檬酸的影响59
• 5.2.2 不同接种量对产柠檬酸的影响59-62
• 5.2.3 不同摇床转速对产柠檬酸的影响62
• 5.2.4 不同培养温度对产柠檬酸的影响62-63
• 5.2.5 发酵过程产酸的变化63-64
• 5.2.6 菌株的传代稳定性64
• 5.2.7 发酵罐培养对菌体形态和柠檬酸产量的影响64-66
• 5.3 小结66-67
• 第六章 总结与展望67-69
• 6.1 总结67-68
• 6.2 展望68-69
• 参考文献69-77
• 附录77-79
• 致谢79-80
• 攻读学位期间发表的学术论文目录80

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本文编号：1034806