褐飞虱细胞色素单加氧酶基因的功能分析

发布时间：2017-10-16 11:03

  本文关键词：褐飞虱细胞色素单加氧酶基因的功能分析

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【摘要】：细胞色素单加氧酶(P450)酶系又称作多功能氧化酶(MFO),是一类代谢酶并且广泛存在于所有需氧生物体,它可以催化和调控内源物质和外源物质的代谢与转化。在昆虫中约有100个左右的P450基因,它们的作用广泛,昆虫对杀虫剂有抗药性和对植物有毒物质有耐受性是因为P450基因能对异源物质有代谢作用。此外P450还参与了昆虫体内两大激素保幼激素、蜕皮激素的合成与代谢。本研究以褐飞虱作为研究对象,通过筛选基因组及转录组,共鉴定到68条P450序列。我们着重对CYP2亚家族进行了功能分析。实时荧光定量PCR结果显示CYP18A1、CYP304H1基因在褐飞虱的整个若虫期内均有表达,且表达量随龄期逐渐升高,但CYP303A1基因则与前两个基因相反,整个若虫期内均有表达,且表达量随龄期逐渐降低。这三个基因在褐飞虱的成虫体内表达量不高；CYP18A1基因在褐飞虱的翅芽中表达量最高,其次是卵巢,体壁。CYP304H1基因在褐飞虱的脂肪体中表达量最高,其次是唾液腺。CYP303A1在体壁和翅芽中表达量非常高。对5龄第一天的若虫进行显微注射dsCYP18A1、dsCYP304H1、 dsCYP303A1, mRNA可被有效下调,褐飞虱5龄若虫的体壁以及蜕皮过程均呈现不同程度的畸形表型,且干扰这三个基因都会使褐飞虱致死；对这三个基因干扰分别干扰3龄、4龄、5龄的褐飞虱若虫,统计三个龄期死亡率,结果显示三个基因对褐飞虱的不同龄期均致死。通过CYP304H1转录组数据,克隆CYP304H1基因片段大小为522bp,可编码含174个氨基酸残基的蛋白,预测分子量为22.3kDa。通过原核表达,回收蛋白制备了CYP304H1蛋白的多克隆抗体。本结果首次发现了褐飞虱CYP304H1对昆虫蜕皮,及体壁发育功能具有重要影响,为进一步研究昆虫P450参与蜕皮激素和保幼激素合成打下基础；同时,利用RNAi技术成功干扰基因表达,褐飞虱不能正常蜕皮及体壁畸形,可以作为褐飞虱防治的潜在靶标基因,这对褐飞虱的迁飞和防治都具有潜在价值。
【关键词】：褐飞虱 P450 RNAi
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.112.3
【目录】：

• 致谢7-8
• 摘要8-9
• Abstract9-14
• 第一章 文献综述14-24
• 1.1 褐飞虱的危害14
• 1.2 细胞色素P450概述14-23
• 1.2.1 昆虫细胞色素P450概述15
• 1.2.2 昆虫细胞色素P450基因功能15-23
• 1.3 本研究的意义23-24
• 第二章 褐飞虱CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的序列分析24-38
• 2.1 材料与方法25
• 2.1.1 实验材料25
• 2.2 常用试剂25-27
• 2.2.1 工具酶及试剂盒25
• 2.2.2 SDS-PAGE试剂25-26
• 2.2.3 Western blot试剂26
• 2.2.4 其它试剂26-27
• 2.3 常用方法27-30
• 2.3.1 CaCl_2法制备感受态细胞27
• 2.3.2 褐飞虱总RNA的提取27-28
• 2.3.3 反转录28
• 2.3.4 连接转化反应28
• 2.3.5 质粒抽提28-29
• 2.3.6 胶回收29
• 2.3.7 PCR反应29
• 2.3.8 CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的生物信息分析29-30
• 2.4 结果分析30-36
• 2.4.1 CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的Scaffold分析30-31
• 2.4.2 序列同源性分析31-36
• 2.5 讨论36-38
• 第三章 CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的表达特性38-46
• 3.1 材料与方法38-40
• 3.1.1 材料38
• 3.1.2 方法38-40
• 3.2 结果与分析40-44
• 3.2.1 CYP304H1在卵、若虫期和成虫的表达量40-41
• 3.2.2 CYP18A1在卵、若虫期和成虫的表达量41
• 3.2.3 CYP303A1在卵、若虫期和成虫的表达量41-42
• 3.2.4 CYP304H1基因在褐飞虱不同组织中的表达差异42-43
• 3.2.5 CYP18A1基因在褐飞虱不同组织中的表达差异43-44
• 3.2.6 CYP303A1基因在褐飞虱不同组织中的表达差异44
• 3.3 讨论44-46
• 第四章 褐飞虱CYP18A1、CYP304H1、CYP303A1基因的RNAi46-64
• 4.1 材料和方法46-47
• 4.1.1 材料46-47
• 4.1.2 实验试剂47
• 4.1.3 引物设计47
• 4.2 方法47-49
• 4.2.1 体外合成dsRNA47-49
• 4.3 结果与分析49-62
• 4.3.1 目的基因合成效果图49-50
• 4.3.2 目的基因的干扰效果50-52
• 4.3.3 目的基因干扰后表型变化52-55
• 4.3.4 目的基因干扰后死亡率55-62
• 4.4 讨论62-64
• 第五章 褐飞虱P450基因CYP304H1原核表达及多克隆抗体制备64-70
• 5.1 材料与方法64-65
• 5.1.1 材料64-65
• 5.2 实验方法65-67
• 5.2.1 基本操作方法65-67
• 5.3 结果与分析67-68
• 5.3.1 原核表达载体构建67-68
• 5.3.2 表达产物Western blot鉴定及多克隆抗体的制备68
• 5.4 讨论68-70
• 总结70-72
• 参考文献72-82
• 在读期间发表的论文82

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本文编号：1042295