Kurthiahuakuii漆酶基因的克隆表达、蛋白纯化与酶学特性研究

发布时间：2017-10-19 10:43

  本文关键词：Kurthiahuakuii漆酶基因的克隆表达、蛋白纯化与酶学特性研究

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【摘要】：漆酶由于能够催化氧化各种酚类和非酚类芳香化合物成水,漆酶被广泛用于合成染料的脱色和脱毒。Kurthia属菌株对三苯甲烷染料和纺织染料废水具有出色的脱色性能。根据Kurthia huakuii LAM0618T基因组注释的结果,并基于生物信息学的分析,本文克隆了一个类漆酶基因laclK,并对laclK的原核表达,重组LaclK的酶学特性及其在染料脱色方面开展了一系列研究。主要结论如下:(1)成功构建了E.coli BL21(DE3)/pET28a-laclK表达菌株。(2)通过IPTG、铜离子以及温度梯度诱导,确定了LaclK诱导表达的最优条件,为0.2 mM IPTG和0.5 mM Cu2+低温16℃诱导。咪唑梯度洗脱确定了重组LaclK最佳的洗脱浓度,为300mM。(3)结构性质:光谱学分析表明LaclK在610 nm和330 nm处未出现漆酶特征吸收峰。铜含量测定表明LaclK只含有1个铜离子。(4)酶学特性:LaclK最适反应温度为65℃,60℃、pH2.5条件下保持6 d酶活无损失,80℃半衰期83 h。LaclK是发现最耐热的酚氧化酶类。LaclK能够催化常见漆酶底物ABTS、2,6-DMP和L-多巴胺。以ABTS、2,6-DMP、L-多巴胺为底物时最适pH分别为2.5、7.0和6.0。LaclK在酸性条件下和中性偏碱性条件下(pH 2.0~9.0)都具有酶活,尤其在酸性条件下(p H 2.5)具有很高的稳定性。铜离子对LaclK发挥酶活性是必要的,0.2 mM的Cu2+浓度使LaclK酶活达到最高。1 mmol的Mg2+,Pb2+,K+,Co2+和Ca2+能促进酶活,而1 mmol的Mn2+,Fe2+,Zn2+和Ag+对LaclK具有抑制作用。LaclK具有很好的有机试剂耐受能力,10%(v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、曲拉通X-100和二甲基亚砜都能促进酶活。L-Cys、EDTA、DTT以及SDS是酶的强抑制剂。LaclK的催化常数Kcat与某些报道的多铜氧化酶很接近,但是比典型的细菌漆酶低了两个数量级左右。LaclK的结构特点和底物特异性表明LaclK为类漆酶多酚氧化酶。(5)染料脱色:LaclK能够在中性偏碱性条件下脱色多种测试的染料,脱色性能优良,在介体ABTS参与下,60℃反应1 h,60 U/L的LaclK对25μM的维多利亚蓝B和乙基紫的脱色率分别达到92%和94%。此外,LaclK还拥有一定的卤化物和有机试剂耐受性,在染料废水的生物修复中具有一定的应用潜力。
【关键词】：Kurthia huakuii LAM0618T 类漆酶 原核表达 酶学特性 耐热 耐酸 染料脱色
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55;Q78
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 绪论13-19
• 1.1 漆酶的种类13-14
• 1.1.1 植物漆酶13
• 1.1.2 昆虫漆酶13-14
• 1.1.3 真菌漆酶14
• 1.1.4 细菌漆酶14
• 1.2 细菌漆酶研究进展14-17
• 1.2.1 细菌漆酶的结构特征14-15
• 1.2.2 细菌漆酶催化的底物15
• 1.2.3 细菌漆酶的催化机理15-16
• 1.2.4 细菌漆酶的应用前景16-17
• 1.2.4.1 降解环境污染物16
• 1.2.4.2 脱色有色工业废水16-17
• 1.2.4.3 生物制浆17
• 1.2.4.4 食品饮料工业17
• 1.2.4.5 生物传感器17
• 1.3 研究目的及内容17-19
• 1.3.1 研究目的及意义17-18
• 1.3.2 研究内容18-19
• 第二章 生物信息学分析19-27
• 2.1 分析方法19
• 2.2 分析结果19-26
• 2.2.1 核苷酸和氨基酸序列分析19-20
• 2.2.2 LaclK保守结构域预测20-22
• 2.2.3 LaclK蛋白信号肽分析及跨膜区域的预测22-23
• 2.2.4 LaclK蛋白的一级结构23-24
• 2.2.5 LaclK二级结构预测24
• 2.2.6 LaclK三级结构预测24-25
• 2.2.7 脂肪族氨基酸指数和不稳定性系数的分析25-26
• 2.3 本章小结26-27
• 第三章 原核表达菌株构建27-34
• 3.1 实验材料和方法27-30
• 3.1.1 实验材料27-28
• 3.1.2 试验方法28-30
• 3.2 结果与讨论30-33
• 3.2.1 laclK基因的扩增30-31
• 3.2.2 pET-28a质粒的提取与BamH I和Xho I双酶切验证31-32
• 3.2.3 表达系统E. coli BL21(DE3)/pET28a-laclK的构建和测序验证32-33
• 3.3 本章小结33-34
• 第四章 重组LaclK的表达和纯化34-42
• 4.1 材料和方法34-37
• 4.1.1 试验材料34
• 4.1.2 试验方法34-37
• 4.2 结果与讨论37-41
• 4.2.1 BSA标准曲线的建立37-38
• 4.2.2 重组LaclK的表达条件38-40
• 4.2.3 LaclK蛋白的纯化40-41
• 4.3 本章小结41-42
• 第五章 LaclK酶学性质研究42-51
• 5.1 实验材料与方法42-44
• 5.1.1 实验材料42
• 5.1.2 实验方法42-44
• 5.2 结果与讨论44-50
• 5.2.1 LaclK的理化特征44-45
• 5.2.2 LaclK的酶促反应动力学45-49
• 5.2.3 LaclK的动力学常数49-50
• 5.3 本章小结50-51
• 第六章 LaclK对染料的脱色研究51-59
• 6.1 实验材料和方法51-52
• 6.1.1 实验材料51
• 6.1.2 实验方法51-52
• 6.2 结果与讨论52-58
• 6.2.1 LaclK的制备与酶活的测定52-53
• 6.2.2 LaclK对不同结构染料的脱色53-54
• 6.2.3 LaclK对乙基紫脱色的研究54-58
• 6.2.3.1 给酶量对乙基紫脱色的影响55
• 6.2.3.2 接种时间对乙基紫脱色的影响55
• 6.2.3.3 乙基紫浓度对脱色的影响55-56
• 6.2.3.4 pH对乙基紫脱色的影响56
• 6.2.3.5 卤离子对乙基紫脱色的影响56-57
• 6.2.3.6 有机试剂对乙基紫脱色的影响57
• 6.2.3.7 NO~(3?)，，SO_4~(2?) 和腐殖酸对乙基紫脱色的影响57-58
• 6.3 本章小结58-59
• 第七章 全文结论及展望59-61
• 7.1 结论59
• 7.2 展望59-61
• 参考文献61-68
• 附录68-70
• 致谢70-71
• 作者简历71-72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 高键;关可兴;焦晶;姜文洙;张应玖;;细菌漆酶的结构、催化性能及其应用[J];分子催化;2014年02期

2 于孟兰;倪金凤;;昆虫漆酶的研究进展[J];生物加工过程;2014年01期

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5 张培培;任随周;许玫英;孙国萍;;微生物对三苯基甲烷类染料脱色的研究进展[J];微生物学通报;2009年09期

6 王岁楼,王琼波;漆酶在食品工业中的应用及其产生菌的研究[J];食品科学;2005年02期

本文编号：1060639