农杆菌介导的MsWRKY11基因对大豆的遗传转化研究

发布时间：2017-10-19 20:23

  本文关键词：农杆菌介导的MsWRKY11基因对大豆的遗传转化研究

  更多相关文章： 农杆菌介导 大豆 MsWRKY11基因 耐盐

【摘要】：大豆是植物蛋白及植物油的主要来源。许多非生物胁迫均会导致大豆产量减少、品质下降等不良后果。利用基因工程技术培育抗逆性良好的转基因大豆新品系,以求能够使我国盐渍土地资源得到充分应用,满足我国对大豆产量与品质不断增长的需求,具有十分重要的研究意义与发展前景。WRKY转录因子在植物生长发育及对胁迫环境的抵抗过程中起着十分重要的作用。本研究从耐盐性较好的紫花苜蓿中克隆得到MsWRKY11基因,通过农杆菌介导大豆遗传转化技术,将其转入大豆。对T2代PCR阳性植株进行盐处理,并测定与耐逆相关的生理指标,分析MsWRKY11基因对提高大豆耐盐性的作用,以期获得耐盐性较好的转基因大豆株系。主要研究结果如下:1.MsWRKY11基因的克隆与序列分析以紫花苜蓿mRNA为模板,克隆了紫花苜蓿基因MsWRKY11。该基因开放读码框全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。对MsWRKY11基因表达产物的氨基酸序列分析发现,该蛋白具有一个锌指结构域和一个WRKY结构域,是典型的WRKY家族成员,与蒺藜苜蓿、大豆、鹰嘴豆等物种的亲缘关系较近。2.MsWRKY11基因植物表达载体的构建构建了MsWRKY11基因的植物表达载体pTF101.1-MsWRKY11,含CaMV35S启动子和筛选标记Bar基因,并将植株表达载体导入根癌农杆菌菌株EHA101中,用于大豆遗传转化。3.MsWRKY11基因对大豆的遗传转化以东农50作为转基因植物受体,通过根癌农杆菌介导法对大豆子叶节进行遗传转化,共得到39株T0代大豆苗,其中草丁膦抗性植株16株,PCR阳性为10株;40株T1代中草丁膦抗性植株20株,PCR阳性植株为8株;590株T2代植株中草丁膦抗性植株156株,PCR阳性植株为83株。4.转MsWRKY11基因大豆的盐胁迫耐受性分析及生理指标检测对表达量较高的3个转MsWRKY11基因大豆株系(TR 1-1、TR 2-2、TR 7-1)与野生型进行200mM NaCl处理,观察其表型并测定其抗逆生理指标。结果表明,在盐胁迫下,转基因大豆较野生型有更好的生长状态。转基因株系的叶绿素含量较野生型下降量少,丙二醛含量、相对电导率均比野生型低,保护酶活性均明显高于野生型植株。
【关键词】：农杆菌介导 大豆 MsWRKY11基因 耐盐
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.1;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第一章 绪论9-15
• 1.1 农杆菌介导大豆的遗传转化9-12
• 1.2 植物转录因子WRKY家族的结构及功能12-13
• 1.3 本研究的目的和意义13-15
• 第二章 Ms WRKY11基因的克隆及植物表达载体的构建15-37
• 2.1 引言15
• 2.2 材料和方法15-25
• 2.2.1 实验材料15-18
• 2.2.2 实验方法18-25
• 2.3 结果与分析25-35
• 2.3.1 紫花苜蓿总RNA提取及c DNA检测25-27
• 2.3.2 Ms WRKY11基因克隆27
• 2.3.3 p MD18T-Ms WRKY11克隆载体的构建27-29
• 2.3.4 Ms WRKY11基因序列的生物信息学分析29-33
• 2.3.5 表达载体p TF101.1-Ms WRKY11构建33-35
• 2.3.6 植物表达载体p TF101.1-Ms WRKY11转化农杆菌35
• 2.4 本章小结35-37
• 第三章 农杆菌介导的Ms WRKY11基因对大豆的遗传转化37-51
• 3.1 引言37
• 3.2 材料和方法37-45
• 3.2.1 实验材料37
• 3.2.2 实验仪器与药品37-39
• 3.2.3 培养基的配置39-41
• 3.2.4 根癌农杆菌介导的大豆遗传转化41-42
• 3.2.5 转基因大豆叶片小量DNA的提取（CTAB法）42-43
• 3.2.6 转基因大豆DNA的PCR鉴定43-45
• 3.2.7 转基因大豆q RT-PCR检测45
• 3.3 结果与分析：45-50
• 3.3.1 Ms WRKY11基因对大豆的遗传转化及抗性植株的获得45-47
• 3.3.2 抗性植株的分子生物学检测47-49
• 3.3.3 转基因大豆T2代q RT-PCR检测49-50
• 3.4 本章小结50-51
• 第四章 转Ms WRKY11基因大豆T2代表型及生理分析51-66
• 4.1 引言51
• 4.2 材料与方法51-56
• 4.2.1 实验材料51
• 4.2.2 实验方法51-56
• 4.3 结果与分析56-65
• 4.3.1 转基因大豆叶片盐胁迫处理(叶盘法）56-57
• 4.3.2 转Ms WRKY11基因大豆T2代表型分析57-59
• 4.3.3 转Ms WRKY11基因大豆T2代叶绿素含量变化59
• 4.3.4 转Ms WRKY11基因大豆T2代相对电导率变化59-60
• 4.3.5 转Ms WRKY11基因大豆T2代丙二醛（MOD）含量变化60-61
• 4.3.6 转Ms WRKY11基因大豆T2代游离脯氨酸（Pro）和可溶性糖含量变化61-63
• 4.3.7 转Ms WRKY11基因大豆T2代超氧化物歧化酶（SOD）活性变化63
• 4.3.8 转Ms WRKY11基因大豆T2代过氧化物酶（POD）活性变化63-64
• 4.3.9 转Ms WRKY11基因大豆T2代过氧化氢酶（CAT）酶活性变化64-65
• 4.4 本章小结65-66
• 第五章 讨论66-69
• 5.1 土地盐化对大豆的影响66
• 5.2 Ms WRKY11基因的分离与鉴定66
• 5.3 Ms WRKY11基因在增加转基因大豆耐盐性中的作用66-68
• 5.4 下一步工作计划68-69
• 结论69-70
• 参考文献70-76
• 致谢76-77

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