火龙果CAT基因在烟草中的遗传转化及功能分析

发布时间：2017-10-20 03:06

  本文关键词：火龙果CAT基因在烟草中的遗传转化及功能分析

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【摘要】：逆境胁迫严重影响植物的分布、生长发育及品质的形成。在逆境胁迫下,植物积累了大量的活性氧(ROS),从而导致膜脂、DNA及其他细胞组分的严重损伤。过氧化氢酶(CAT)属血红蛋白酶类,主要催化H2O2分解为H2O与O2,CAT的过量表达可有效清除植株体内的ROS,提高其对氧化胁迫的抗性。火龙果(Hylocereus undulatus)为仙人掌科三角柱属的果用栽培种,原产于中美洲热带沙漠地区,耐热耐旱,具有很高的利用价值。前期工作中,我们克隆了火龙果CAT基因(HuCAT),并在mRNA水平上分析了该基因与非生物胁迫的关系。本文拟构建HuCAT的植物表达载体,并通过遗传转化模式植物烟草,在干旱与低温逆境胁迫下对转基因烟草的生理指标进行分析,以期进一步探讨HuCAT的高效超表达提高植物抗逆性的潜在功能。主要结果如下:1、据前期克隆的火龙果过氧化氢酶基因(HuCAT)设计特异引物,从克隆载体PMD18T-HuCAT中扩增出特异带,将其连入植物表达载体pSH737,构建了CaMV35s启动子驱动的表达载体pSH737-HuCAT。2、采用农杆菌介导法转化烟草,获得37个抗性植株,经GUS组织化学染色及PCR扩增鉴定,有29个株系为转基因植株;经半定量RT-PCR及荧光定量PCR检测,筛选出高表达株系22个。3、以PEG-6000溶液模拟干旱胁迫条件,测定转基因烟草的抗旱相关生理指标。结果显示,转基因植株水势、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、叶绿素、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和脯氨酸(PRO)含量、相对含水量均高于野生型;丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H2O2)含量、相对电导率低于野生型,说明转HuCAT基因提高了烟草的抗旱性。4、在恒温光照培养箱里低温(4℃)处理2天,转基因烟草CAT、SOD和POD活性,可溶性糖、可溶性蛋白及PRO含量均高于野生型,而MDA含量低于野生型,意味着转HuCAT基因提高了烟草的抗寒性。因此,HuCAT的高效表达能够提高烟草抗干旱和低温胁迫的能力,其作用机理与消除逆境胁迫下的氧化胁迫相关。
【关键词】：火龙果CAT基因 植物表达载体 遗传转化 基因表达 功能验证
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S667.9;Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 名词缩写表9-10
• 1 文献综述10-23
• 1.1 逆境胁迫对植物生长的影响10-11
• 1.1.1 干旱胁迫对植物生长的影响10-11
• 1.1.2 低温胁迫对植物生长的影响11
• 1.2 植物适应逆境胁迫的机制11-17
• 1.2.1 植物适应逆境胁迫的形态机制11-12
• 1.2.2 植物适应逆境胁迫的生理生化机制12-15
• 1.2.3 植物逆境胁迫下的基因应答机制15-17
• 1.3 过氧化氢酶与植物抗逆性17-19
• 1.3.1 过氧化氢酶的结构与功能17-18
• 1.3.2 过氧化氢酶的抗氧化作用18
• 1.3.3 CAT基因工程研究18-19
• 1.4 基因的功能验证19-20
• 1.4.1 基因的超表达用于功能验证19-20
• 1.4.2 基因失活在基因功能分析的作用20
• 1.5 火龙果的抗逆相关基因20-21
• 1.6 本研究的目的、意义及技术路线21-23
• 1.6.1 目的与意义21-22
• 1.6.2 技术路线22-23
• 2 材料与方法23-47
• 2.1 试验材料23
• 2.1.1 试验材料23
• 2.1.2 干旱胁迫23
• 2.1.3 低温胁迫23
• 2.2 实验试剂及仪器设备23-24
• 2.2.1 主要试剂23-24
• 2.2.2 主要仪器24
• 2.3 HuCAT基因植物表达载体构建24-33
• 2.3.1 添加酶切位点的引物设计24-25
• 2.3.2 中间表达载体的构建25-29
• 2.3.3 植物表达载体的构建29-32
• 2.3.4 植物表达载体导入农杆菌LBA440432-33
• 2.4 农杆菌介导烟草遗传转化33-36
• 2.4.1 培养基33
• 2.4.2 烟草叶片材料的处理33
• 2.4.3 农杆菌的培养及活化33-34
• 2.4.4 HuCAT遗传转化烟草34
• 2.4.5 GUS组织化学染色检测34
• 2.4.6 PCR分子检测34-36
• 2.5 转基因植株中HuCAT基因的表达分析36-40
• 2.5.1 PCR模板制备36-38
• 2.5.2 半定量RT-PCR38
• 2.5.3 荧光定量PCR38-40
• 2.6 转基因烟草抗旱生理生化指标的测定40-46
• 2.6.1 水势40
• 2.6.2 相对含水量40-41
• 2.6.3 过氧化氢（H2O2）含量41
• 2.6.4 可溶性糖（SS）含量41-42
• 2.6.5 可溶性蛋白（SP）含量42
• 2.6.6 叶绿素含量42-43
• 2.6.7 过氧化氢酶（CAT）活性43
• 2.6.8 超氧化物歧化酶（SOD）活性43-44
• 2.6.9 过氧化物酶（POD）活性44-45
• 2.6.10 脯氨酸（PRO）含量45
• 2.6.11 丙二醛（MDA）含量45
• 2.6.12 相对电导率（REC）45-46
• 2.7 转基因烟草抗寒生理生化指标的测定46
• 2.8 数据统计分析46-47
• 3 结果与分析47-70
• 3.1 HuCAT基因植物表达载体的构建47-49
• 3.1.1 目的基因的PCR扩增47
• 3.1.2 HuCAT的T载体克隆与测序验证47-48
• 3.1.3 载体质粒双酶切48-49
• 3.2 农杆菌介导烟草遗传转化49-50
• 3.2.1 pSH737-HuCAT转化农杆菌49-50
• 3.2.2 HuCAT遗传转化烟草50
• 3.3 转基因植株的鉴定50-51
• 3.3.1 GUS组织化学染色50-51
• 3.3.2 PCR检测51
• 3.4 HuCAT表达分析51-56
• 3.4.1 PCR模板的制备51-52
• 3.4.2 半定量RT-PCR检测52-54
• 3.4.3 HuCAT表达的荧光定量PCR检测54-56
• 3.5 干旱胁迫对转HuCAT烟草生长的影响56
• 3.6 干旱胁迫下生理生化指标的变化56-65
• 3.6.1 水势56-57
• 3.6.2 相对含水量57-58
• 3.6.3 过氧化氢（H202）含量58
• 3.6.4 可溶性糖（SS）含量58-59
• 3.6.5 可溶性蛋白（SP）含量59-60
• 3.6.6 叶绿素含量60-61
• 3.6.7 CAT活性61
• 3.6.8 SOD活性61-62
• 3.6.9 POD活性62-63
• 3.6.10 游离脯氨酸（PRO）含量63-64
• 3.6.11 丙二醛（MDA）含量64
• 3.6.12 相对电导率（REC）64-65
• 3.7 低温胁迫对转HuCAT基因烟草形态的影响65
• 3.8 低温胁迫对生理生化指标的影响65-70
• 3.8.1 CAT活性65-66
• 3.8.2 SOD活性66-67
• 3.8.3 POD活性67
• 3.8.4 可溶性糖（SS）含量67-68
• 3.8.5 可溶性蛋白（SP）含量68
• 3.8.6 游离脯氨酸（PRO）含量68-69
• 3.8.7 丙二醛（MDA）含量69-70
• 4 讨论70-73
• 4.1 转基因烟草耐逆性的生理生化机制70-71
• 4.2 HuCAT基因的功能分析71-73
• 5 结论73-74
• 6 后续工作展望74-75
• 参考文献75-82
• 致谢82-83
• 附录83-84

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