酒石酸衍生的阳离子脂质材料的制备及其基因转染活性研究

发布时间：2017-10-20 12:04

  本文关键词：酒石酸衍生的阳离子脂质材料的制备及其基因转染活性研究

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【摘要】：目的:基因治疗需要高效安全的载体系统将基因递送到靶细胞或细胞核内。基因治疗载体主要分为病毒载体与非病毒载体两大类。非病毒载体因其负载量大,稳定性和安全性高,易于大规模生产等优点,成为目前基因载体研究的热点。阳离子脂质体是目前研究最为广泛的非病毒载体,在基因治疗中具有广阔的发展与应用前景。本论文以酒石酸为骨架,通过在酒石酸羟基端引入氨基己酸为阳离子头部,在其羧基端引入不同长度的疏水链制备得到新型骨架的阳离子脂质材料,以期为基因治疗提供高效低毒的载体。方法:以L-(+)-酒石酸,6-氨基己酸,长链烷基胺或醇(辛胺,十二胺,十六胺,辛醇,十二醇,十六醇)等为原料,构建了单链阳离子脂质材料(TS1-TS3)和双链阳离子脂质材料(TD1-TD3)。采用质谱、核磁、红外等方法对合成的材料进行结构鉴定。将上述脂质材料与辅助脂质DOPE按照一定比例混合,采用薄膜分散法制备得到阳离子脂质体并对其进行表征和细胞毒性评价。采用凝胶电泳阻滞方法考察所得6种阳离子脂质体与质粒DNA的复合能力和核酶降解保护作用,为基因转染筛选适宜的N/P比。以293T细胞和报告基因p EGFP-N1为模型,采用流式细胞仪和荧光显微镜对上述阳离子脂质体的转染能力进行初步评价。对初筛转染活性较好的阳离子脂质材料进行处方优化,并进一步考察其在He La细胞中的转染活性。选用不同细胞内吞途径抑制剂观测TD2/DNA复合物的入胞机制。结果:设计合成了6种基于L-(+)-酒石酸的阳离子脂质材料,包括3种单链阳离子脂质材料TS1-TS3和3种双链阳离子脂质材料TD1-TD3,经1H NMR,MS和IR等方法鉴定,所得脂质材料的结构与目标物的结构一致。阳离子脂质体粒径及zeta电位测定结果表明,所制备的6种阳离子脂质体粒径均小于150 nm,zeta电位均在35 m V以上,满足基因递送载体的要求。MTT细胞毒性实验结果表明,所设计的阳离子脂质材料毒性较低,具有较好的生物相容性,上述阳离子脂质体除TD1外,IC50均大于阳性对照DOTAP。凝胶阻滞实验结果显示,在N/P比小于3的情况下,所制备的阳离子脂质体均能与DNA完全复合,具有较强的携载DNA能力。6种载体材料在293T细胞中的基因转染活性测定结果表明,单链阳离子脂质材料TS1-TS3脂质体转染活性均较差,与裸DNA几乎无差异。双链阳离子脂质材料TD1转染能力较弱,TD2和TD3具有较好的转染活性。TD2和TD3的进一步处方优化结果显示,最优脂质材料/DOPE比例分别为1:0.5和1:2;最优N/P比均为1:1。与阳性对照DOTAP相比,TD2(MFI153.3±14.7)和TD3(MFI 190.5±7.8)的平均荧光强度与DOTAP(MFI 171.1±14.5)无显著性差异,但TD2(47.7%±7.0%)与TD3(32.9%±2.0%)两者的阳性转染细胞百分数均高于DOTAP(24.7%±1.8%;P0.01),具有更好的转染活性。He La细胞上的转染实验结果表明,TD2(MFI 53.8±6.2)和TD3(MFI 54.7±2.0)的平均荧光强度虽小于DOTAP(MFI 98.0±1.8,P0.01),但TD3(19.6%±0.9%)的阳性转染细胞百分数与DOTAP(18.3%±0.9%)相当,TD2(25.6%±0.4%)的阳性转染细胞百分数仍优于DOTAP,具有较强的基因转染能力。TD2/DNA复合物入胞机制研究结果表明,TD2与DNA形成的复合物主要通过小窝蛋白介导的途径入胞。结论:本论文在L-(+)-酒石酸骨架中引入6-氨基己酸作为阳离子头部,引入不同长度的疏水链分别构建了单链与双链疏水尾部的6种阳离子脂质材料并对其细胞毒性和基因转染活性进行研究。研究结果显示,除TD1外,上述阳离子脂质材料所得基因载体具有粒径均一,细胞毒性小,携载和保护DNA能力强等优点。其中TD2阳离子脂质体的基因转染能力最强,在293T和He La细胞系上均显示很好的转染活性,且TD2与DNA形成的复合物主要通过小窝蛋白介导的途径入胞,该途径可以避免被溶酶体降解,有利于提高该类基因递送系统的转染效率。
【关键词】：非病毒载体 阳离子脂质体 阳离子脂质 L-(+)-酒石酸 细胞毒性 基因转染
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-29
• 第一部分 L-（+）-酒石酸阳离子脂质材料的合成及其结构表征29-42
• 1 材料29-30
• 2 方法30-40
• 3 结果与讨论40-42
• 第二部分 阳离子脂质体的制备、表征及体外毒性的研究42-47
• 1 材料42
• 2 方法42-44
• 3 结果与讨论44-47
• 第三部分 阳离子脂质体的基因转染活性及入胞机制研究47-59
• 1 材料47-48
• 2 方法48-51
• 3 结果与讨论51-59
• 小结59-60
• 参考文献60-72
• 附录72-100
• 个人简历和研究成果100-101
• 致谢101

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本文编号：1067032