小麦重结晶抑制蛋白IRI基因功能及小麦族IRI基因家族的分子进化

发布时间：2017-10-21 20:22

  本文关键词：小麦重结晶抑制蛋白IRI基因功能及小麦族IRI基因家族的分子进化

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【摘要】：小麦(Triticum aestivum L.)是全球种植面积最大的重要粮食作物之一。小麦耐寒力是限制小麦年产量的最主要因素之一。因此,针对此现状,充分利用小麦耐寒基因资源、挖掘新型耐寒基因,并深入剖析其抗寒机制,对于改善小麦抗寒力及选育小麦耐冷新品种有着重要的指导意义。重结晶抑制蛋白(Ice Recrystallization Inhibition protein, IRI)能结合于冰晶表面抑制冰晶生长和冰的重结晶,从而提高植物抗寒能力。小麦野生近缘属种是小麦品种改良的重要基因库,可为改善小麦抗寒力提供丰富的基因资源。本试验以抗寒性极强的强冬性小麦品种M808为试材,分离鉴定得到6个IRI基因；以春小麦材料中国春(China Spring, CS)为对照,研究了不同低温处理下该IRI基因家族成员间的表达差异；选择两个代表性IRI基因在烟草中过表达,利用低温致死试验和相对电导率等相关生理指标变化验证了该基因的抗冻功能；在小麦野生近缘属种材料中广泛分离并成功克隆到22个IRI基因,并对该基因家族成员进行了分子进化分析。主要结果如下：1.强冬性小麦IRI基因分离、序列比对及表达分析本研究分离鉴定得到6个IRI基因,分别命名为TaIRI3, TaIRI4, TaIRI5, TaIRI6、 TalRI7、 TaIRI8,编码氨基酸个数分别为285、285、285、288、287、287,这些IRI基因以基因家族形式存在,都具有典型IRI蛋白的保守区特征,包括：N端信号肽、亮氨酸富集重复区(LRR区)、重结晶抑制区(IRI区)及若干个保守半胱氨酸。尽管IRI氨基酸序列的保守性极高,但这些序列之间仍存在差异区域。根据差异位点的不同,我们可以把这6个IRI氨基酸序列分为两类,TaIRI3、 TalRI4、 TaIRI5为Ⅰ类,TaIRI6、 TaIRI7、 TaIRI8为Ⅱ类。相较于Ⅰ类氨基酸序列,Ⅱ类氨基酸序列分别在173处、285处多出脯氨酸(P)和苏氨酸(T),另有TaIRI6在172处多出谷氨酰胺(Q)。进化分析表明小麦IRI基因编码的氨基酸序列可聚为3类：TaIRI3、 TaIRI4、 TaIRI5与已发表的TalRIl聚为一类,为Group I; TaIRI6、 TaIRI7与TaIRI8聚为一类,为Group II; TaIRI2单独聚为一类,为GroupIII 。以CS为对照材料,经不同低温处理后,利用实时荧光定量PCR对CS和M808的TalRI基因家族成员表达情况进行分析,结果表明TaIRI基因家族成员表达存在明显差异,且在M808的表达量高于CS。其中,在4℃处理24h后,Group I中TaIRI4表达量最高,Group II中TaIRI6表达量最高,推测这两个基因分别为两个聚类群的主效表达基因。2.转基因烟草检测及抗寒功能鉴定将两个代表性基因TaIRI4和TaIRI6转入烟草中已经得到的T1代植株,通过Southern杂交检测,转基因烟草基因组DNA所在泳道有清晰可见的条带,证明目的基因已成功整合到烟草中。通过低温胁迫试验,观察不同低温处理下各植株表型变化情况,并测定存活率、电导率、脯氨酸、MDA等指标,发现转基因烟草长势明显强于野生型烟草,存活率普遍高于野生型烟草的存活率；在低温胁迫后细胞膜受伤程度较低,细胞膜脂过氧化程度低,MDA含量较少,电解质渗出较少,相对电导率较低,并积累了大量脯氨酸以维持细胞基本结构、调节渗透压,表现出较强的抗冻性。综合比较多个指标得出各材料抗寒能力依次为：转TaIRl6烟草转TaIRI4烟草野生型烟草。3.小麦族IRI基因家族分离及进化分析在小麦野生近缘属种材料中广泛分离得到22个IRI基因,这些基因以基因家族形式存在,都具有IRI蛋白的典型保守区特征,包括N端信号肽、LRR区、IRI区及若干个保守半胱氨酸。进化分析表明,小麦族IRI基因与其同源基因聚为9类,这些基因之间存在种属特异性,其中,所有山羊草属IRI基因单独聚为一类(Group I)；多数小麦属IRI基因单独聚为一类(Group II)；大麦属部分基因与小麦属基因聚在Group II,其余分别聚在GroupⅦ和GroupⅧ；发草属基因聚在GroupⅣ和GroupⅥ。山羊草属与小麦属亲缘关系最近。这些基因与PSR基因具有很高的同源性,推测IRI蛋白可能为双功能蛋白。
【关键词】：小麦族 抗寒性 重结晶抑制蛋白基因 进化分析
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S512.1
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 文献综述14-22
• 1.1 AFPs的概述14-17
• 1.1.1 AFPs的发现14
• 1.1.2 AFPs的分类及特点14-16
• 1.1.3 AFPs的性质16-17
• 1.2 植物AFPs的研究进展17-19
• 1.2.1 植物AFPs的特性17-18
• 1.2.2 植物AFPs结构特点18
• 1.2.3 植物AFPs的高级结构18-19
• 1.3 AFPs的应用19-20
• 1.3.1 AFPs在食品领域的应用19
• 1.3.2 AFPs在农业领域的应用19-20
• 1.4 小麦族AFPs研究进展20-22
• 第二章 强冬性小麦IRI基因的分离、序列比对及表达分析22-33
• 2.1 试验材料22-23
• 2.1.1 植物材料与处理22
• 2.1.2 菌株及质粒22
• 2.1.3 其它试剂22-23
• 2.1.4 所用仪器及生物学软件23
• 2.2 试验方法23-26
• 2.2.1 总RNA的提取23
• 2.2.2 反转录合成第一链cDNA23
• 2.2.3 IRI基因的PCR扩增23-24
• 2.2.4 PCR扩增产物的胶回收24
• 2.2.5 TA克隆24
• 2.2.6 序列测定与分析24
• 2.2.7 实时荧光定量PCR24-26
• 2.3 结果与分析26-32
• 2.3.1 植物总RNA的提取26
• 2.3.2 小麦IRI基因的分离26-27
• 2.3.3 小麦IRI氨基酸序列比对及结构分析27-30
• 2.3.4 小麦IRI基因家族分子进化分析30
• 2.3.5 小麦IRI基因家族各成员表达分析30-32
• 2.4 结论32-33
• 第三章 转基因烟草检测及抗寒功能鉴定33-43
• 3.1 试验材料33-34
• 3.1.1 植物材料与处理33
• 3.1.2 试验试剂及配制33-34
• 3.1.3 所有仪器及生物学软件34
• 3.2 实验方法34-37
• 3.2.1 探针的制备34-35
• 3.2.2 探针浓度的定量标记35
• 3.2.3 Southern杂交步骤35-36
• 3.2.4 低温胁迫试验36-37
• 3.3 结果与分析37-41
• 3.3.1 定量标记探针效率结果37
• 3.3.2 Southern杂交结果37-38
• 3.3.3 表型鉴定结果38-39
• 3.3.4 存活率测定39
• 3.3.5 低温胁迫下转基因烟草相对电导率变化39-40
• 3.3.6 低温胁迫下转基因烟草脯氨酸变化40-41
• 3.3.7 低温胁迫下转基因烟草MDA变化41
• 3.4 结论41-43
• 第四章 小麦族IRI基因分离及进化分析43-54
• 4.1 试验材料43
• 4.1.1 植物材料与处理43
• 4.1.2 菌株及质粒43
• 4.1.3 其它试剂43
• 4.1.4 所用仪器及生物学软件43
• 4.2 试验方法43-44
• 4.2.1 总RNA的提取43-44
• 4.2.2 反转录合成第一链cDNA44
• 4.2.3 IRI基因的PCR扩增44
• 4.2.4 PCR扩增产物的胶回收44
• 4.2.5 TA克隆44
• 4.2.6 序列测定与分析44
• 4.3 结果与分析44-52
• 4.3.1 所获序列基本信息44-46
• 4.3.2 所获序列比对分析结果46-50
• 4.3.3 小麦族IRI基因及其相关基因进化分析50-52
• 4.4 结论52-54
• 第五章 讨论与结论54-56
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 攻读硕士学位期间发表文章62

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