野生二粒小麦与普通小麦杂种高世代α-,γ-醇溶蛋白基因的分子鉴定

发布时间：2017-10-25 07:19

  本文关键词：野生二粒小麦与普通小麦杂种高世代α-,γ-醇溶蛋白基因的分子鉴定

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【摘要】：麦谷蛋白和麦醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白中的主要成分,二者是小麦面筋组成的两大成分,二者的种类和数量及其比例决定着小麦面粉的加工品质,从而影响着面筋的质量。在小麦籽粒中,麦醇溶蛋白占贮藏蛋白的40%-50%,赋予了面筋可塑性、黏性、延展性,同时醇溶蛋白中还含有诱发乳糜泻(celiac disease,CD)的主要外在因子。因此,筛选优质的醇溶蛋白基因改良普通小麦的加工品质以及降低乳糜泻的发病率,对小麦遗传育种具有重要意义。野生二粒小麦是栽培四倍体硬粒小麦和六倍体普通小麦的祖先种,具有很多优良的性状以及普通小麦所缺乏的独特的遗传变异,是进行普通小麦遗传改良的适宜供体。本研究通过对野生二粒小麦D97、普通小麦川农16(CN16)及其二者杂种高世代(F11,2n=6x=42)的四份材料BAd7-209、BAd7-210、BAd7-212、BAd7-213,进行α-,γ-醇溶蛋白基因的分子克隆,利用GenBank中已有的基因序列资源,同克隆测序后的基因序列进行比对分析、氨基酸序列分析并构建系统进化树,揭示野生二粒小麦改良普通小麦醇溶蛋白的优异遗传基础,进而为野生二粒小麦在普通小麦品质改良和CD预防中的利用,提供参考。主要取得以下结果：(1)一共克隆了248个α-醇溶蛋白基因序列,85个Y-醇溶蛋白基因序列,其中α-,γ-醇溶蛋白基因具有完整编码框的基因序列分别为129个、68个,其余的由于在编码区存在着提前终止子,推测为假基因。(2)进一步分析表明,得到的所有基因序列推导的氨基酸序列都具有a-醇溶蛋白或γ-醇溶蛋白典型的结构。在α-醇溶蛋白基因序列中,亲本川农16和4个杂种高代材料都得到了含有7个半胱氨酸的序列,都是在C-末端特征区Ⅱ,因密码子TCC颠换为TGC使丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)。同时,在BAd 7-210、BAd 7-212、BAd 7-213中克隆到了缺少1个保守半胱氨酸的序列。其中,7-212-α1-13中第1个半胱氨酸(C)因TGC转换为TAC而突变成了酪氨酸(Y)；7-210-α1-2、7-212-α1-19和7-213-α1-1均因密码子TGT转换为CGT使第3个半胱氨酸(C)突变成了精氨酸(R)；7-210-α2-13和7-213-α2-7中,由于TGC转换为CGC,而使第4个半胱氨酸(C)突变成了精氨酸(R)；此外,7-212-a1-12中由于TGC转换为CGC,使第5个半胱氨酸(C)突变成了精氨酸(R)。在γ-醇溶蛋白基因序列中,除BAd7-213外,得到了含有7个或9个半胱氨酸的序列。例如,D97-γ-3与CN16-γ-4由于密码子TAT转换为TGT,使位于C-末端区非重复区V的酩氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)；在D97-γ-1、D97-γ-4、D97-,γ-5、D97-γ-6、D97-γ-7、D97-γ-12、D97-γ-14、CN16-γ-9、CN16-γ-10、CN16-γ-11、7-209-γ-2、7-209-γ-3、7-210-γ-9、7-212-γ-5、7-212-γ-7等在N-末端重复区Ⅱ,由于密码子TAC转换为TGC,致使酪氨酸(Y)突变成为半胱氨酸(C)。而7-209-γ-13在非重复区Ⅲ,由于密码子TGT颠换为GGT,而使半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G),导致基因缺少了1个保守的半胱氨酸；类似地,7-212-γ-2与7-212-γ-8在非重复区Ⅲ,由于密码子TGT转换为CGT,致使半胱氨酸(C)突变为精氨酸(R)。系统进化分析表明,在C-末端特征区Ⅱ具有额外半胱氨酸的α-醇溶蛋白基因,大多数来源于D基因组。而在N-末端重复区Ⅱ具有额外半胱氨酸的γ-醇溶蛋白基因,大多来源于B基因组。在野生二粒小麦D97得到了较普通小麦川农16更多的额外半胱氨酸的醇溶蛋白基因,据此认为,有望通过野生二粒小麦改良普通小麦的加工品质。(3)从克隆到的基因序列中对T细胞免疫肽进行了识别分析,表明野生二粒小麦D97和川农16以及四个杂种高代材料都具有足够的潜力诱发CD。但是进一步分析发现,在D97所克隆得到的序列中,D97-α2-14和D97-α1-22被定位在6B染色体上,它们的多聚谷氨酰胺含量比较特殊,其多聚谷氨酰胺Ⅱ区的多聚谷氨酰胺含量反而比多聚谷氨酰胺Ⅰ区的含量少很多或者数量接近。D97-α2-6、D97-α2-13、D97-Ⅱ2-16这三个基因仅含有Glia-a20,并被定位在6A染色体。而在杂种后代BAd7-209中,发现了类似的基因7-209-α1-19。表明在D97中存在一定的变异类型,有望从中筛选出含有较少T细胞免疫优势多肽的优异种质资源。
【关键词】：普通小麦 野生二粒小麦 α-醇溶蛋白 γ-醇溶蛋白 序列分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S512.1
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 1 文献综述11-21
• 1.1 小麦种子储藏蛋白的组成及分类11-12
• 1.2 小麦品质12-13
• 1.2.1 小麦品质的分类12-13
• 1.2.2 小麦品质改良的研究现状13
• 1.3 小麦醇溶蛋白的研究现状13-17
• 1.3.1 醇溶蛋白等位变异的分离和鉴定13-14
• 1.3.2 醇溶蛋白基因的染色体定位、等位变异及其与小麦品质的关系14-16
• 1.3.3 小麦醇溶蛋白的氨基酸组成分析16-17
• 1.3.4 醇溶蛋白基因的克隆17
• 1.4 醇溶蛋白与乳糜泻的关系17-18
• 1.5 野生二粒小麦在小麦品质改良中的独特地位和作用18-19
• 1.6 本研究的立题目的与意义19-21
• 2 材料与方法21-26
• 2.1 实验材料21
• 2.2 实验方法21-26
• 2.2.1 基因组DNA的提取21-22
• 2.2.2 目的基因的PCR扩增22-23
• 2.2.3 PCR产物的回收纯化23
• 2.2.4 连接23-24
• 2.2.5 制备感受态细胞24
• 2.2.6 转化24
• 2.2.7 阳性筛选24-25
• 2.2.8 DNA序列测定与拼接25-26
• 3 结果与分析26-75
• 3.1 A-醇溶蛋白26-52
• 3.1.1 α-醇溶蛋白核苷酸序列分析26-29
• 3.1.2 推导的氨基酸序列分析29-44
• 3.1.3 半胱氨酸位置和数目分析44-45
• 3.1.4 毒性多态位点分析45-50
• 3.1.5 α-醇溶蛋白基因的聚类分析50-52
• 3.2 Γ-醇溶蛋白52-75
• 3.2.1 γ-醇溶蛋白核苷酸序列分析52-54
• 3.2.2 推导的氨基酸序列分析54-69
• 3.2.3 毒性肽分析69-71
• 3.2.4 γ-醇溶蛋白基因的聚类分析71-75
• 4 讨论75-81
• 4.1 A-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析75-76
• 4.2 A-醇溶蛋白基因的T细胞免疫肽的分布、染色体定位与CD预防76-78
• 4.3 Γ-醇溶蛋白的分子变异及其与功能的关系78-79
• 4.4 氨基酸序列比对分析所揭示的Γ-醇溶蛋白结构与功能关系79-80
• 4.5 Γ-醇溶蛋白的T细胞免疫肽的分布与CD预防80-81
• 参考文献81-90
• 致谢90

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1092660