正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析

发布时间：2016-09-05 12:15

  本文关键词：牛规模化转基因技术体系构建轨迹和展望，，由笔耕文化传播整理发布。

《内蒙古大学》 2016年

正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析

吕洋  

【摘要】：机体维持正常的生理机能和健康,需要控制体内代谢平衡。一些重要的转录因子可以直接或间接的影响营养和代谢链,如胆固醇、脂质、葡萄糖和胰岛素等可以快速改变基因表达的程序,从而维持代谢平衡。microRNAs(miRNAs)可以调控动物多种生理生化活动,在基因表达的转录水平或转录后水平表现为重要的调控分子,miRNAs可能也参与调控体细胞克隆动物和转基因克隆动物的表观遗传。利用Solexa测序技术,分别检测并分析2头体内受精(in vivo fertilization,Ferti)牛、2头克隆牛(somatic cell nuclear transfer,SCNT)和2头转fat-1基因牛(transgenic, TG)的成纤维细胞中的miRNA表达谱,共建立了6个miRNAs文库。利用Mireap软件,分析miRNA的表达差异,探讨成纤维细胞中miRNAs的表达规律,并预测了差异miRNAs调控的靶基因。通过基因GO (Gene ontology)数据库富集分析和全基因组及代谢途径数据库(KEGG)通路分析,研究了这些靶基因参与的生物学通路,初步揭示了体内受精、克隆和转基因来源的牛中的miRNA表达和靶向基因之间的关系。结果表明：1.运用miRNAs测序技术,共检测了367个已知miRNAs,其中83个、19个和23个已知miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达,14个已知miRNAs在三者中共同表达；新发现了178个数据库未公布的miRNAs,其中17个、1个和4个新的候选miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达,1个新的候选miRNA在三者中共同表达。2.通过筛选体内受精、克隆和转fat-1基因牛成纤维细胞中的差异表达miRNA,发现成纤维细胞中存在一系列上调和下调的miRNA。通过Real time RT-PCR方法检测、验证和比较体内受精、克隆和转基因组三组中表达量前10个miRNA的差异,同时对表达量高的2个新的候选miRNA进行荧光定量PCR验证,并预测部分高表达的候选miRNA结构。GO富集分析和KEGG通路分析显示,差异表达miRNA对应靶基因显著富集的通路主要在代谢通路、MAPK信号通路、钙离子信号通路、嘌呤代谢通路、泛素介导的蛋白水解通路、嘧啶代谢通路和细胞周期通路等7个生物学通路。3.通过生物信息学软件预测FGF10、LPL和ATGL可能作为bta-miR-21的靶基因,荧光定量PCR验证后发现,与克隆牛和转基因牛成纤维细胞相比,FGF10和ATGL的mRNA在体内受精牛成纤维细胞中表达显著降低,而bta-miR-21在体内受精牛成纤维细胞中表达显著升高,初步认为bta-miR-21与FGF10和ATGL的表达存在负调控的关系。4.microRNA的功能鉴定。利用在体外水平过表达或敲减bta-miR-21,检测靶基因的表达变化,进一步证明bta-miR-21与FGF10和ATGL的靶向关系,bta-miR-21可能通过调控FGF10和ATGL的表达发挥作用。结论：1.本研究建立了遗传背景一致,不同来源胚胎(体内受精、克隆和转fat-1基因牛)成纤维细胞的miRNA文库,获得了可能影响克隆、转基因克隆后代发育的miRNA信息,为深入揭示克隆与转基因克隆胚胎发育异常的机制提供了重要参考。2.本研究发现bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL在体内受精、克隆和转fat-1基因牛胎儿成纤维细胞中具有调控作用,推测bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL可能是克隆与转基因克隆胚胎发育调控的重要靶标。

【关键词】：
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

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