高产纤维素酶黑曲霉菌基因克隆及表达研究

发布时间：2017-10-28 06:24

  本文关键词：高产纤维素酶黑曲霉菌基因克隆及表达研究

  更多相关文章： 黑曲霉 纤维二糖酶 重组毕赤酵母 响应面 发酵动力学

【摘要】：纤维素是地球上最丰富的可再生资源,可利用率低,有的直接采用焚烧的方法,引起严重的环境污染。在自然环境中存在大量能够降解纤维素的微生物,因此可利用微生物对纤维素进行降解,产生一系列有用的副产物,还能减少对环境的污染。而纤维素的水解需要纤维素酶,纤维素被内切酶和外切酶水解成纤维二糖和低聚糖后,由纤维二糖酶将以上产物水解生成葡萄糖。纤维二糖酶用途广泛,不仅能应用于生物燃料,解决紧缺的燃料问题,而且可应用于食品、化工、生物制造等诸多工业生产中。因此对纤维二糖酶的研究具有重要的理论和实用价值。本论文的主要结果如下：1.以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉C112菌株RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆黑曲霉C112的纤维二糖酶基因bgl(GenBank登录号：KP307454)；该基因全长2934bp,含有非编码序列,编码860个氨基酸,等电点为4.70,蛋白质理论分子量为93.33kD,核酸序列与数据库的Aspergillus niger(GenBank登录号JX982101.1)同源性达到了99%；其中A644个、T666个、G834个、C790个,G+C含量为55.35%。酸性氨基酸残基总数(Asp+Glu)为99,碱性氨基酸(Arg+Lys)为64,表明其为酸性蛋白质。20种氨基酸中甘氨酸(Gly)含量最高,为10.7%：丙氨酸(Ala)次之,为9.07%。2.以pPIC9K作为黑曲霉纤维二糖酶基因的表达载体,筛选得到阳性克隆；采用化学转化手段将带有目的基因的pPIC9K质粒转化入毕赤酵母SMD1168中；通过SDS-PAGE蛋白电泳检测到大小为93.3 kD的蛋白条带,与预期目的蛋白大小相符。3.对重组毕赤酵母菌产纤维二糖酶进行分析,以YG为培养基,每隔12h取发酵上清液,测定纤维二糖酶酶活力,发酵时间为96 h时纤维二糖酶酶活力最高,纤维二糖酶酶活力达到30.37 U/mL；纤维二糖酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0。用1 mM Mg2+处理之后纤维二糖酶的相对活力最高,相对酶活力为110.2±6.5%；用1 mM Mg2、K+、Ca2+和Pb2+处理都能够有效的增加酶的活力,1mM Na+和Fe2+对酶活没什么影响,而1mM Fe3+、Li+、Zn2+、Cu2+、 Mn2+和Ag+对纤维二糖酶具有抑制作用。化学试剂2 mg/mL SDS和10mM EDTA对纤维二糖酶酶活影响不大,1 mM β-mercaptoethanol能够有效的提高纤维二糖酶的酶活力。说明一定的金属离子能够有效提高纤维二糖酶的活力。4.利用产纤维二糖酶的重组毕赤酵母,确定基础发酵培养基最佳碳源、氮源,并在摇瓶发酵基础上,采用单因素试验法从诱导时间、接种量、pH值、甲醇浓度考察发酵条件对纤维二糖酶活力、蛋白表达量和菌体生物量的影响,利用响应面分析法确定关键影响因子的最佳参数。优化后的基础发酵培养基最佳碳源为麸皮2.5%(W/V),最佳氮源为玉米浆粉3.0%(W/V)。获得最佳发酵条件为：诱导时间96 h、接种量为15%(V/V)、初始pH值5.0、甲醇浓度1.0%(V/V)。在此最佳发酵条件下,纤维二糖酶的理论酶活最大值达到32.80 U/mL。验证试验发酵培养基纤维二糖酶活为(32.24±0.51)U/mL,外源蛋白表达量为(131.57±1.52)mg/L,与预测值接近。5.在摇床优化的基础上,利用5L发酵罐对重组毕赤酵母产纤维二糖酶的发酵过程进行了放大,并且该菌株在5L发酵罐中分批发酵的数据为参考,结合数学推导,建立了分批发酵生产纤维二糖酶的菌体生成,纤维二糖酶的合成以及基质消耗动力学模型,如下：(1)菌体生长动力学模型(2)基质消耗动力学模型(3)纤维二糖酶合成动力学模型所建模型基本能够描述重组毕赤酵母产纤维二糖酶的动态过程,可以为以后的进一步的工业放大实验提供理论参考。
【关键词】：黑曲霉 纤维二糖酶 重组毕赤酵母 响应面 发酵动力学
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q55
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词表9-15
• 1 绪论15-27
• 1.1 纤维素酶(CELLULASE)15-17
• 1.2 纤维二糖酶17-20
• 1.2.1 纤维二糖酶的理化性质17-18
• 1.2.2 纤维二糖酶的分类18
• 1.2.3 纤维二糖酶的作用机制18-19
• 1.2.4 纤维二糖酶的底物特异性19
• 1.2.5 纤维二糖酶的活性测定19-20
• 1.3 纤维二糖酶的应用20-21
• 1.3.1 在食品领域中的应用20
• 1.3.2 在医药领域中的应用20-21
• 1.3.3 纤维二糖酶的其它应用21
• 1.4 纤维二糖基因工程研究进展21-23
• 1.4.1 纤维二糖酶基因的克隆21-22
• 1.4.2 纤维二糖酶基因的原核表达22-23
• 1.4.3 纤维二糖酶基因的真核表达23
• 1.5 毕赤酵母表达系统23-25
• 1.5.1 毕赤酵母表达系统的优点23-24
• 1.5.2 毕赤酵母表达载体24-25
• 1.5.3 毕赤酵母发酵优化25
• 1.6 研究的目的及内容25-27
• 1.6.1 研究目的、意义25-26
• 1.6.2 研究内容26-27
• 2 纤维二糖酶基因的克隆及鉴定27-38
• 2.1 材料27-29
• 2.1.1 菌种27
• 2.1.2 仪器设备27
• 2.1.3 酶与试剂27-28
• 2.1.4 培养基28
• 2.1.5 溶液配制28-29
• 2.2 实验方法29-34
• 2.2.1 黑曲霉C112总RNA的提取29
• 2.2.2 cDNA单链的合成29-30
• 2.2.3 RT-PCR扩增30-31
• 2.2.4 PCR产物纯化回收31
• 2.2.5 PCR产物与载体的连接31-32
• 2.2.6 连接产物的转化32
• 2.2.7 阳性转化子的鉴定32-34
• 2.3 结果与分析34-37
• 2.3.1 黑曲霉C112总RNA的提取及纤维二糖酶基因的PCR扩增结果34-35
• 2.3.2 重组克隆的蓝白斑筛选35
• 2.3.3 重组克隆的鉴定35-36
• 2.3.4 克隆基因序列分析36-37
• 2.4 小结与讨论37-38
• 3 纤维二糖酶基因真核表达载体的构建38-45
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 菌种与质粒38
• 3.1.2 仪器设备38
• 3.1.3 酶与试剂38-39
• 3.1.4 质粒pPIC9K的物理图谱39
• 3.1.5 培养基39
• 3.1.6 溶液配制39
• 3.2 实验方法39-42
• 3.2.1 纤维二糖酶基因的回收39-40
• 3.2.2 真核表达载体pPIC9K质粒的回收40
• 3.2.3 纤维二糖酶基因和真核表达载体质粒的连接40-41
• 3.2.4 连接产物转化大肠杆菌Trans5α41
• 3.2.5 重组转化子的鉴定41-42
• 3.3 结果与分析42-44
• 3.3.1 重组质粒和表达载体pPIC9K的双酶切鉴定42-43
• 3.3.2 重组表达载体PCR鉴定43
• 3.3.3 重组表达载体的双酶切鉴定43-44
• 3.4 小结与讨论44-45
• 4 纤维二糖酶基因电击转化毕赤酵母45-54
• 4.1 材料45-47
• 4.1.1 菌种与试剂45
• 4.1.2 仪器设备45
• 4.1.3 培养基45-46
• 4.1.4 溶液配制46-47
• 4.2 试验方法47-50
• 4.2.1 重组质粒pPIC9K-bg1线性化47
• 4.2.2 毕赤酵母SMD1168感受态细胞的制备47-48
• 4.2.3 毕赤酵母的化学转化48
• 4.2.4 重组酵母PCR鉴定和测序鉴定48-49
• 4.2.5 SDS-PAGE检测目的蛋白49-50
• 4.3 结果与分析50-52
• 4.3.1 重组酵母菌PCR检测结果50-51
• 4.3.2 SDS-PAGE蛋白电泳检测结果51-52
• 4.4 小结与讨论52-54
• 5 重组毕赤酵母产酶活性测定54-61
• 5.1 材料与方法54-55
• 5.1.1 菌种54
• 5.1.2 仪器与设备54
• 5.1.3 培养基54
• 5.1.4 溶液配制54-55
• 5.2 试验方法55-57
• 5.2.1 粗酶液的制备55
• 5.2.2 重组毕赤酵母菌纤维二糖酶活力测定55-56
• 5.2.3 纤维二糖酶最适反应温度和温度稳定性的测定56
• 5.2.4 纤维二糖酶最适反应pH和pH温度性的测定56
• 5.2.5 金属离子和化学试剂对酶活力的影响56-57
• 5.3 结果与分析57-60
• 5.3.1 重组毕赤酵母菌纤维二糖酶活性测定结果57
• 5.3.2 温度对纤维二糖酶酶活力和稳定的影响57-58
• 5.3.3 pH对纤维二糖酶酶活力和稳定的影响58-59
• 5.3.4 金属离子和化学试剂对纤维二糖酶酶活力的影响59-60
• 5.4 小结与讨论60-61
• 6 重组毕赤酵母产纤维二糖酶发酵工艺优化61-72
• 6.1 材料61-62
• 6.1.1 菌种与试剂61
• 6.1.2 仪器与设备61
• 6.1.3 培养基61-62
• 6.1.4 产物的测定62
• 6.2 试验方法62-63
• 6.2.1 重组毕赤酵母菌株种子液的培养62
• 6.2.2 发酵培养基单因素试验62-63
• 6.2.3 响应面优化63
• 6.3 结果与分析63-71
• 6.3.1 纤维二糖酶标准曲线63
• 6.3.2 培养基发酵工艺条件的确定63-67
• 6.3.3 响应面分析法优化培养条件67-71
• 6.3.4 最佳工艺条件预测与试验验证71
• 6.4 小结与讨论71-72
• 7 重组毕赤酵母产纤维二糖酶发酵动力学研究72-81
• 7.1 材料与方法72-73
• 7.1.1 菌种与试剂72
• 7.1.2 仪器与设备72-73
• 7.1.3 培养基73
• 7.2 试验方法73-75
• 7.2.1 斜面种子培养73
• 7.2.2 摇瓶种子培养73
• 7.2.3 分批发酵73
• 7.2.4 分析方法73-75
• 7.2.5 试验数据的测定75
• 7.3 结果与分析75-79
• 7.3.1 重组毕赤酵母产纤维二糖酶发酵过程中代谢变化规律75-76
• 7.3.2 分批发酵动力学模型的建立76-79
• 7.4 小结与讨论79-81
• 8 结论与展望81-84
• 8.1 结论81-82
• 8.2 展望82-84
• 9 创新84-85
• 参考文献85-93
• 附录93-94
• 攻读学位期间的主要学术成果94-95
• 致谢95

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 沈雪亮,夏黎明;固定化纤维二糖酶的研究[J];生物工程学报;2003年02期

2 ;[J];;年期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 沈雪亮;可再生纤维素原料生物转化产乳酸的研究[D];浙江大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 朱永瑞;高产纤维素酶黑曲霉菌基因克隆及表达研究[D];中南林业科技大学;2016年

2 何可可;海洋曲霉纤维二糖酶的发酵、纯化与性质研究[D];浙江大学;2012年

3 赵海峰;液体深层发酵产纤维二糖酶及其在木质纤维素协同水解中的应用[D];浙江大学;2012年

4 阳芳;嗜热厌氧菌纤维二糖酶的克隆表达及酶学性质表征[D];华南理工大学;2015年

5 冀彤;黑曲霉纤维二糖酶基因在酵母细胞中的表达[D];浙江大学;2011年

，

本文编号：1107029