玉米脆秆突变体基因初定位及芒草农杆菌介导转基因体系初探

发布时间：2017-10-28 09:25

  本文关键词：玉米脆秆突变体基因初定位及芒草农杆菌介导转基因体系初探

  更多相关文章： 脆秆突变体 Mutator转座子 细胞壁 纤维素 机械强度 芒草 愈伤 农杆菌介导 遗传转化

【摘要】：玉米秸秆不仅作为生物质能源的重要原材料,在饲料以及其他生物与工业产品中也占有极其重要的地位。脆秆突变体是研究细胞壁形成机制以及对细胞壁改良的重要资源。本实验自交系Zong31和带有Mu转座活性的自交系W22交杂构建的突变体库中,筛选得到了茎秆和叶片都明显表现为脆性的突变体植株,命名为Y04,经多代自交和表型的鉴定,获得了稳定的纯合突变体。本研究应用形态学、细胞学、和遗传学等方法分析了此突变体与正常玉米的茎秆穿刺力、成熟期生物学性状的测定、成熟期茎秆的显微结构、秸秆细胞壁成分的差异、纤维素影响因子的测定,并将引起脆性表型的基因br(brittle stalk)进行了初步定位。为今后深入研究脆性基因的克隆、功能的分析以及生物质能源利用等提供了材料和理论基础。主要结果如下:1)田间表型观测:在种子萌发和幼苗阶段,突变体和正常玉米植株生长情况并无差异。在突变体生长约至4周即四叶一心期时,开始出现脆性,所有器官均表现为脆性,且整个生育期持续存在。2)突变体的茎秆与Zong31相比,组织韧性和穿刺力强度减弱,极其容易被折断。茎秆穿刺力测定结果表明:脆性植株茎秆的穿刺力较Zong31和Mu有极显著降低,分别降低了46.1%和68.5%。3)徒手切片染色结果显示:脆性植株茎秆维管束数目、分布及皮层周围细胞层数与正常植株差异不大。主要是维管束细胞的纤维素含量降低,木质素含量升高。扫描电镜观测显示:突变体维管束鞘细胞厚壁组织细胞壁厚度明显变薄,排列疏松。4)茎秆细胞壁化学成分测定的结果表明:脆秆突变体中,纤维素含量占干物质总量的12.77%,极显著低于正常植物的31.2%;纤维素结晶度极显著低于Zong31的21.5%;淀粉含量占干物质总量的0.75%,显著性低于Zong31的24.2%;可溶性糖含量占干物质总量的33.56%,显著性高于Zong31的18.6%。半纤维素略有下降,木质素和果胶含量略有升高,均较对照差异不明显。5)Y04脆性基因br(brittle stalk)克隆结果显示与bk2并不相同,在Zong31背景下较br与bk2有多处单碱基缺失,在1472-1557之间有几处较大缺失,对缺失片段进行群体检测发现并不是由此缺失引起表型的改变。6)2013年秋天在武汉实验基地种植的F1单株,田间表型正常;2015年春天汉川实验基地种植的约1500株单株F2群体中正常和脆性植株的分离比为1150:244,损失脆秆约为106株,符合3:1分离比。图位克隆方法将br基因定位在9号染色体上,锁定在bnlg1159和umc1771之间,且br与umc1120和umc2121共分离,目标基因br距离umc2398和umc1771最近,遗传距离分别是11.5c M和3.1c M,说明目标基因br更靠近umc1771标记。芒(Miscanthus sinensis)是自然界中分布最为广泛的芒属物种,它是目前国际上研究最为热门的三倍体交杂种芒草-巨芒(M.×giganteus)其中的二倍体亲本,是开展遗传改良的遗传种质基础。新品种的选育是大面积种植和利用芒属能源植物需要解决的首要问题,遗传转化技术是进行遗传改良最有效的途径之一,其中农杆菌介导的遗传转化以其成本低、转化效率高、易操作等优势被广泛的应用到外源基因导入到受体细胞的过程中去。本研究以芒的幼穗作为外植体诱导胚性愈伤作为受体材料,研究了以农杆菌介导的遗传转化法为基础,活性炭,农杆菌菌液浓度,乙酰丁香酮浓度的差异,表面活性剂,超声波处理等对转化效率的影响。其主要的结果如下:1)在诱导15天的培养过程中,没有添加活性炭(AC)的培养基褐化严重;在添加了0.2%AC的培养基中,褐化并不明显。2)统计诱导80天后,愈伤在诱导培养基上的生长状态,没有添加活性炭的培养基上诱导出愈伤较添加了0.2%活性炭的培养基要多。没有添加活性炭(AC)培养基的出愈率为79.0%,而添加了0.2%AC的培养基的出愈率为38.9%。3)不同农杆菌菌液OD600和时间组合侵染胚性愈伤,并将转化后的愈伤分别经过第一次选择和第二次选择后,只有OD600=0.7,侵染30min这个组合下的愈伤,在经过两次筛选后有存活下来的愈伤。故农杆菌菌液OD600=0.7,侵染30min为最佳组合。4)超声波在农杆菌侵染愈伤过程中的处理,在侵染过程中利用超声波分别处理0、2、4、8、300、600、1200s后,将愈伤接种到一选培养基上,0、2、4、8s处理过的愈伤均全部死亡,而经过300、600、1200s超声处理过后的愈伤在经过二选后,几乎全部存活下来,说明,较长时间超声波处理对愈伤的转化的提高有显著作用。
【关键词】：脆秆突变体 Mutator转座子 细胞壁 纤维素 机械强度 芒草 愈伤 农杆菌介导 遗传转化
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S513
【目录】：

• 第一章 玉米脆秆突变体基因初定位7-48
• 摘要7-9
• Abstract9-10
• 缩写名词表10-11
• 1 文献综述11-18
• 1.1 植物细胞壁的结构11-13
• 1.2 脆秆性状研究进展13-14
• 1.3 COBRA研究进展14-15
• 1.4 影响三大成分降解转化因子的研究进展15-17
• 1.5 研究的目的和意义17-18
• 2 材料与方法18-31
• 2.1 材料来源18
• 2.2 遗传群体的构建、田间性状的考察18
• 2.3 主要使用仪器和试剂18-19
• 2.4 植株叶片DNA的提取19
• 2.5 叶片脆性考察19
• 2.6 其他生物形状考察19-20
• 2.7 叶脉、茎秆组织的显微学观察20
• 2.8 脆性基因的克隆20-24
• 2.8.1 引物设计20-21
• 2.8.2 PCR体系21
• 2.8.3 PCR产物的回收21-22
• 2.8.4 TA克隆22
• 2.8.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化22-23
• 2.8.6 菌落PCR23-24
• 2.8.7 质粒DNA的提取24
• 2.9 成熟植株秸秆三大成分与产糖24-28
• 2.9.1 生物质稀酸预处理及酶解24-25
• 2.9.2 生物质稀碱预处理及酶解25
• 2.9.3 细胞壁多糖成分提取和测定25-26
• 2.9.4 细胞壁木质素含量测定26-27
• 2.9.5 比色法测定六碳糖和五碳糖27
• 2.9.7 纤维素Cr I测定27-28
• 2.9.8 扫描电镜观察28
• 2.10 图位克隆粗定位、精细定位28-31
• 2.10.1 试剂和仪器28-29
• 2.10.2 SSR标记PCR体系和扩增29
• 2.10.3 聚丙烯酰胺凝胶的制作及电泳29-31
• 3 结果与分析31-46
• 3.1 脆杆突变体的形态观察31-32
• 3.2 脆性考察32-33
• 3.3 生物学性状考察33-34
• 3.4 脆杆突变体茎秆组织扫描电镜观察34-37
• 3.5 茎秆细胞壁成分测定37-39
• 3.6 成熟期秸秆降解转化效率测定39-41
• 3.7 Zong31、突变体Y04在bk2区域的扩增41-43
• 3.8 脆杆突变体Y04基因bk图位克隆43-46
• 4 讨论与展望46-48
• 第二章 芒草农杆菌介导转基因体系初探48-72
• 摘要48-49
• Abstract49-50
• 缩写名词表50-51
• 1 论文综述51-57
• 1.1 芒草的种类、分布、产量、作为能源作物的特殊性51
• 1.2 农杆菌在单子叶植物遗传转化的研究进展51-54
• 1.2.1 农杆菌转化的机理与特点51-52
• 1.2.2 影响农杆菌介导单子叶植物遗传转化的因素52-54
• 1.3 芒草组织培养和遗传转化的研究进展54-55
• 1.4 基因枪轰击转化的研究进展55-57
• 1.4.1 基因枪转化的基本原理和特点56
• 1.4.2 影响基因枪转化的因素56-57
• 2 材料和方法57-63
• 2.1 材料57-58
• 2.1.1 植物材料57
• 2.1.2 菌株与质粒57
• 2.1.3 培养基配方57-58
• 2.2 试验方法58-63
• 2.2.1 愈伤组织的准备58-59
• 2.2.2 农杆菌活化培养59
• 2.2.3 农杆菌侵染59-60
• 2.2.4 选择培养60
• 2.2.5 分化培养及生根培养60
• 2.2.6 基因枪轰击转化法60-63
• 3 结果与分析63-69
• 3.1 活性炭对芒W70、W89诱导愈伤率的影响63-64
• 3.2 菌液浓度对转化效率的影响64-66
• 3.3 侵染液中乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响66-67
• 3.4 侵染过程中表面活性剂TWEEN-20、silwet L-77 对转化效率的影响67-68
• 3.5 超声波处理对转化效率的影响68
• 3.6 基因枪方法68-69
• 4.讨论69-72
• 参考文献72-82
• 附录 182-85
• 附录 285-88
• 个人简历88-89
• 致谢89-90

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