鼠李糖基转移酶原核基因工程菌的构建与表达条件优化

发布时间：2017-10-28 15:18

  本文关键词：鼠李糖基转移酶原核基因工程菌的构建与表达条件优化

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【摘要】：新橙皮苷在植物内的含量较低,其同分异构体橙皮苷在植物体内含量较高。两者的结构上的差异仅仅是黄酮环上取代基上葡萄糖与鼠李糖的糖苷键不同。本研究希望利用生物转化法将橙皮苷转化为新橙皮苷。本文通过构建一株原核工程菌来表达鼠李糖基转移酶,该酶可以催化鼠李糖与葡萄糖通过1,2糖苷键连接,以此来合成新橙皮苷,并且对其酶学性质进行研究,还对工程菌的产酶发酵条件进行了优化研究。主要的研究内容及结果如下:1.原核工程菌的构建及表达:从Lactobacillus plantarum WCFS1的基因组中扩增得到编码鼠李糖基转移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family 2(GT2)基因,将该目的基因与表达载体pET-DsbA连接,得到重组表达载体pET-DsbA-GT2。将表达载体导入表达菌株BL21(DE3),成功构建得到了原核表达工程菌BL21(pET-DsbA-GT2);采用诱导剂IPTG对工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)进行诱导表达,GT2与DsbA成功的融合表达,得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白(其中,GT2的大小为35.7 kDa,DsbA的大小为21 kDa)。表达方式为部分包涵体、部分可溶性表达。2.鼠李糖基转移酶的分离纯化及其酶学性质的研究:通过分离纯化分别得到了包涵体蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶(GT2-2)两种鼠李糖基转移酶。酶活测定结果显示GT2-1的比活力为0.41 U/mg,远低于可溶性目的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶学性质的研究结果:GT2-1、GT2-2两种酶的最适反应温度38-40℃,最适pH值为6.0-6.5;GT2-1、GT2-2在20-40℃处理1 h后的酶活仍能达到90%以上,当温度超过40℃时,GT2-1的酶活随着温度的升高迅速降低,当温度达到70℃时便完全失去酶活,GT2-2温度达到80℃才完全失去酶活;GT2-1、GT2-2在pH值在5-10这个范围内均具有较好的稳定性。3.重组菌BL21(pET-DsbA-GT2)表达条件的优化:以表达系数F和表达量Q为表征量,对BL21(pET-DsbA-GT2)重组菌的表达条件进行了优化。最后得到的最优表达条件为:诱导时机选择为培养10-12 h后进行诱导;诱导时间为5-6h;诱导温度为30℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL;摇床转速为160 rpm。
【关键词】：新橙皮苷 橙皮苷 鼠李糖基转移酶 基因克隆 酶学性质 分离纯化
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;TQ925
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-10
• 第1章 绪论10-25
• 1.1 引言10-11
• 1.2 橙皮苷简介11-17
• 1.2.1 橙皮苷的理化性质11-12
• 1.2.2 橙皮苷的应用12-14
• 1.2.3 橙皮苷的改性研究进展14-17
• 1.3 新橙皮苷简介17-20
• 1.3.1 新橙皮苷的来源17-19
• 1.3.2 新橙皮苷的应用19-20
• 1.4 糖基转移酶研究进展20-22
• 1.4.1 植物次生合成代谢中糖基化的作用21
• 1.4.2 糖基转移酶基因的研究进展21-22
• 1.5 本文的研究意义和内容22-25
• 1.5.1 研究的意义22-23
• 1.5.2 研究的内容23-25
• 第2章 鼠李糖基转移酶原核基因工程菌的构建与表达25-45
• 2.1 引言25-27
• 2.2 实验材料27-31
• 2.2.1 菌株与质粒27
• 2.2.2 主要试剂与酶27-28
• 2.2.3 主要仪器28
• 2.2.4 培养基28-29
• 2.2.5 主要溶液配制29-30
• 2.2.6 引物30-31
• 2.3 实验方法31-38
• 2.3.1 菌株活化31
• 2.3.2 DH5α和BL21感受态细胞制备31-32
• 2.3.3 GT2基因的扩增32-33
• 2.3.4 p UCm-T-GT2克隆载体的构建33-34
• 2.3.5 重组质粒（p UCm-T-GT2）转化至DH5α34
• 2.3.6 重组质粒（p UCm-T-GT2）的检测34-35
• 2.3.7 重组表达载体（p ET-Dsb A-GT2）的构建35-37
• 2.3.8 重组BL21(p ET- Dsb A-GT2) 菌株的构建37
• 2.3.9 BL21（p ET- Dsb A-GT2）重组菌株的诱导表达37
• 2.3.10 SDS-PAGE电泳检测诱导表达37-38
• 2.4 结果与讨论38-43
• 2.4.1 GT2基因的扩增38-39
• 2.4.2 GT2基因的测序结果39-40
• 2.4.3 p UCm-T-GT2克隆载体的验证40
• 2.4.4 p ET-Dsb A质粒提取结果40-41
• 2.4.5 重组表达载体p ET-Dsb A-GT2验证41-42
• 2.4.6 重组菌株BL21诱导表达结果42-43
• 2.5 本章小结43-45
• 第3章 鼠李糖基转移酶的体外复性、纯化及其性质的研究45-63
• 3.1 引言45-46
• 3.2 实验材料46-49
• 3.2.1 菌株46
• 3.2.2 主要试剂46-47
• 3.2.3 主要仪器47-48
• 3.2.4 培养基48-49
• 3.3 实验方法49-55
• 3.3.1 菌株活化49
• 3.3.2 鼠李糖基转移酶的分离与纯化49-51
• 3.3.3 鼠李糖基转移酶酶活测定51-54
• 3.3.4 鼠李糖基转移酶酶学性质的研究54-55
• 3.4 结果与讨论55-61
• 3.4.1 鼠李糖基转移酶纯化结果55-56
• 3.4.2 鼠李糖基转移酶酶活检测结果56-57
• 3.4.3 鼠李糖基转移酶酶学性质的研究结果57-61
• 3.5 本章小结61-63
• 第4章 重组工程菌BL21(p ET- Dsb A-GT2) 诱导表达条件的优化63-74
• 4.1 引言63
• 4.2 实验材料63-64
• 4.2.1 菌株63
• 4.2.2 主要试剂63-64
• 4.2.3 主要仪器64
• 4.2.4 培养基64
• 4.2.5 主要溶液配制64
• 4.3 实验方法64-68
• 4.3.1 菌株活化64-65
• 4.3.2 目的蛋白表达形式的分析方法65-66
• 4.3.3 培养条件的优化66-68
• 4.4 结果与讨论68-72
• 4.4.1 诱导时机的优化68-69
• 4.4.2 诱导时间的优化69
• 4.4.3 诱导温度的优化69-70
• 4.4.4 诱导剂IPTG浓度的优化70-71
• 4.4.5 摇床转速的优化71-72
• 4.5 本章小结72-74
• 第5章 结论与展望74-76
• 5.1 总结74-75
• 5.2 展望75-76
• 致谢76-77
• 参考文献77-85
• 附录85-86
• 攻读学位期间的研究成果86

【参考文献】

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本文编号：1108799