沉默CCR和CAD基因培育低木质素含量转基因多年生黑麦草

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７２－８３２０１３年１０月　　　草　业　学　报　　　

ＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　　　　Ａ　　第２２卷　第５期

Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．５

沉默ＣＣＲ和ＣＡＤ基因培育低木质素

含量转基因多年生黑麦草

２２２，，，胡可１，严雪锋１，栗丹１，唐晓梅１，杨宏１，王艳１，邓洪渊１，马欣荣１＊

（）中国科学院成都生物研究所，四川成都６中国科学院研究生院，北京１１．１００４１；２．０００４９

摘要：木质素作为维管植物的重要成分之一，主要存在于细胞的次生壁中。然而，木质素却是许多工农业加工过程的限制因素，例如在化学制浆、牧草消化以及木质纤维转化为生物酒精等过程中。肉桂酰辅酶Ａ还原酶（和ＣＣＲ）是催化木质素单体生物合成最后两步的关键酶。本研究根据Ｎ肉桂醇脱氢酶（ＣＡＤ）ＣＢＩ中黑麦草ＣＣＲ和ＣＡＤ基从野生型多年生黑麦草ｃ分别因序列设计特异引物并添加相应酶切位点，ＤＮＡ分离克隆ＣＣＲ和ＣＡＤ基因片段，构建了含正反方向目的片段的植物表达干扰载体ｐ２３２３ｉＣＣＲ和ｐｉＣＡＤ。通过根癌农杆菌ＥＨＡ１０５介导转入多－－年生黑麦草胚性愈伤组织，经过巴龙霉素筛选和ＰＣＲ检测获得导入了干扰ＣＣＲ和ＣＡＤ基因片段的转基因株系结果显示，与对照相比，有９株ｉｉＣＲ和ｉＡＤ。常规方法测定相对木质素含量，ＣＲ植株和１１株ｉＡＤ植株木－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃ质素含量显著降低，分别平均降低了３且生长正常。本研究表明通过干扰Ｃ４．６７％，３３．８６％，ＣＲ和ＣＡＤ基因表可以获得低木质素含量的多年生黑麦草，为进一步培育易消化吸收的黑麦草提供了良好的种质资源。达，

；关键词：木质素；肉桂酰辅酶Ａ还原酶；肉桂醇脱氢酶；多年生黑麦草；遗传转化ＲＮＡｉ

＋

（）中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４６．６０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９２０１３０５００７２１２－－－

：／ＤＯＩ１０．１１６８６ｃｘｂ２０１３０５０９　　ｙ

主要存在于植物细胞的次生壁，与纤维素和半纤维素共价结合，　　木质素是一种复杂的芳香族化合物多聚体，

赋予细胞壁强度和硬度，为植物组织提供机械支持，使得植株向上生长。木质素还使植物的脉管组织具有疏水

１］２］

，。在大多数被子植物中，性，便于水分和营养物质的长距离运输［还能保护植株避免病原体入侵［木质素主要

）和紫丁香基木质素（这两种木质素单体亚单位构成，它们分别来自松柏醇由愈创木基木质素（ＧｌｉｎｉｎＳｌｉｎｉｎ）－－ｇｇ和芥子醇，第三种木质素单体亚单位对羟基苯基木质素（来自香豆醇，它在单子叶植物中相对较多，而Ｈ－ｌｉｎｉｎ）ｇ

１］３，４］

。图１为木质素合成途径［。在双子叶植物中较少［

５］

。木质素作为维管束植物细胞壁的主要成分，长期以来被认为不利于饲料品质、造纸和纤维素燃料的生产［

６］

。在草料消化和例如，在制浆造纸工业中，需通过严格的化学工艺从木材中去除木质素以获得纯的纤维素纤维［７］

。因此，低木质素含量的牧草或者木材的培育，是育种的方向之一。如生产乙醇时木质素也是主要的限制因子［

今大部分研究主要是通过基因工程手段降低植株的木质素含量或者改变其组成。

［３，４］

，木质素单体作为组成木质素的亚单位，产生于苯丙氨酸途径的一个分支（图１）肉桂酰辅酶Ａ还原酶

（，，和肉桂醇脱氢酶（是催化木质素单体生ｃｉｎｎａｍｏｌＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅＣＣＲ）ｃｉｎｎａｍｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅＣＡＤ）　　　　ｙｙｙｇ物合成最后两步的关键酶。许多研究通过在不同植物中抑制这两种酶的表达降低了木质素含量或是改变了木质

１］

。素的组成［

在木质素的生物合成中起着重要作用，它以５种羟基肉桂酸的ＣＣＣＲ是木质素特异途径的关键酶之一，ｏＡ酯（对－香豆酰辅酶Ａ、咖啡酰辅酶Ａ、阿魏酰辅酶Ａ、作为底物催化生成相５－羟基阿魏酰辅酶Ａ和芥子酰辅酶Ａ）应的肉桂醛。Ｃ突变体，木质素含量降低的同时表现出外ＣＲ１基因表达受影响的拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）　ｐ

８］

。Ｃ形矮小、衰老延缓的性状［木质素含量可降低ＣＲ下调的转基因杨树（Ｐｏｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ×Ｐｏｕｌｕｓａｌｂａ）　　ｐｐ

；改回日期：２０１２０５０７２０１２０６０６＊收稿日期：－－－－

））基金项目：国家８和国家自然科学基金项目（资助。６３计划项目（２００９ＡＡ１０Ｚ１０８，２００８ＡＡ１０Ｚ４０９３０１７０５８９，：＿作者简介：胡可（男，四川江油人，硕士。Ｅ－ｍ１９８６ａｉｌｄｄ１２２＠１６３．ｃｏｍ－）ｊｙｊｙ

：ａｉｌｍａｘｒｉｂ．ａｃ．ｃｎ＊通讯作者。Ｅ－ｍ＠ｃ

３，４］

图１　苯丙烷和木质素单体生物合成途径，重点显示了木质素单体的合成途径［

Ｆｉ．１　Ｐｈｅｎｌｒｏａｎｏｉｄａｎｄｍｏｎｏｌｉｎｏｌｂｉｏｓｎｔｈｅｔｉｃａｔｈｗａｓｍａｉｎｌｓｈｏｗｉｎｂｉｏｓｎｔｈｅｓｉｓａｔｈｗａｓｏｆｍｏｎｏｌｉｎｏｌｓ　　　　　　　　ｇｙｐｐｇｙｐｙｙｇｙｐｙｇ　　

；；ＡＬ：苯丙氨酸解氨酶ＰｈｅａｍｍｏｎｉａｌａｓｅＣ４Ｈ：肉桂酸４ｉｎｎａｍａｔｅ４ｈｄｒｏｘｌａｓｅ４ＣＬ：４ｈｄｒｏｘｃｉｎ　Ｐ　－－羟化酶Ｃ　－－羟基肉桂酰辅酶Ａ连接酶４－－ｙｙｙｙｙ；；Ｃ／ｎａｍｏｌｏＡｌｉａｓｅＣ３Ｈ：对香豆酸３ｃｏｕｍａｒａｔｅ３ｈｄｒｏｘｌａｓｅＯＭＴ：咖啡酸／５ａｆｆｅｉｃ５ｈｄｒｏｘｆｅｒｕｌｉｃ－Ｃ　－羟化酶ｐ－　－－羟基阿魏酸－Ｏ－甲基转移酶Ｃ－ｙｇｙｙｙｙ；；ＨＣ；Ｏ－ｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＦ５Ｈ：阿魏酸５ｅｒｕｌａｔｅ５ｈｄｒｏｘｌａｓｅＴ：羟基肉桂酸转移酶ＨｄｒｏｘｃｉｎｎａｍｏｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＣＣｏＡＯＭＴ：咖ａｃｉｄ　－羟化酶Ｆ　－ｙｙｙｙｙｙ；；啡酰辅酶Ａ甲基转移酶ＣａｆｆｅｏｌｏＡ　Ｏ－ｍｅｔｈｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＣＣＲ：肉桂酰ＣｏＡ还原酶ＣｉｎｎａｍｏｌｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅＣＡＤ：肉桂醇脱氢酶Ｃｉｎｎａｍｌａｌ－Ｃ－Ｃ　－－ｙｙｙｙ；；芦丁：Ｒ；山奈酚二糖苷阿魏酸：ｌｃｏｓｉｄｅｃｏｈｏｌｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅＳＡＤ：芥子醇脱氢酶Ｓｉｎａｌａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅ．芦丁－７ｕｔｉｎ７ｕｔｉｎ　－　－糖苷：Ｒ－－ｙｇｐｙｙｇｇｙ；山奈酚二糖苷丙二酸酯：Ｋ；山奈酚－Ｏ；黄酮类化Ｋａｅｍｆｅｒｏｌｄｉｌｃｏｓｉｄｅｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄａｅｍｆｅｒｏｌｄｉｌｃｏｓｉｄｅｍａｌｏｎａｔｅａｅｍｆｅｒｏｌｌｃｏｓｉｄｅ　　　　　－糖苷：Ｋ－Ｏ－ｐｇｙｐｇｙｐｇｙ；苯丙氨酸：；肉桂酸：；对－香豆酸：；咖啡酸：；阿魏酸：；合物：ＦｌａｖｏｎｏｉｄＰｈｅｎｌａｌａｎｉｎｅＣｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄｃｏｕｍａｒｉｃａｃｉｄＣａｆｆｅｉｃａｃｉｄＦｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ５　－　　　－羟基ｙｐ；芥子酸：；对－香豆酰辅酶Ａ：；香豆酰奎尼阿魏酸：５ｄｒｏｘｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄＳｉｎａｉｃａｃｉｄｃｏｕｍａｒｏｌｏＡ；香豆酰莽草酸：Ｃｏｕｍａｒｏｌｓｈｉｋｉｍｉｃａｃｉｄ－Ｈ　　－－Ｃ　　ｙｙｐｐｙｙ；咖啡酰辅酶Ａ：酸：ＣｏｕｍａｒｏｌａｃｉｄＣａｆｆｅｏｌｏＡ；阿魏酰辅酶Ａ：ＦｅｒｕｌｏｌｏＡ；５５ｈｄｒｏｘｆｅｒｕｌｏｌｏＡ；芥子酰辅酶ｕｉｎｉｃ　　－Ｃ－Ｃ－羟基阿魏酰辅酶Ａ：－－Ｃｙｙｙｙｙｙｑ；咖啡醛：；松柏醛：；；Ａ：ＳｉｎａｏｌｏＡ；对－香豆醛：ｃｏｕｍａｒａｌｄｅｈｄｅＣａｆｆｅｏｌａｌｄｅｈｄｅＣｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｄｅ５５ｈｄｒｏｘｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｄｅ－Ｃ－　－羟基松柏醛：－ｐｙｐｙｙｙｙｙｙｙ　；对－香豆醇：；松柏醇：；；芥子醇：芥子醛：ＳｉｎａａｌｄｅｈｄｅｃｏｕｍａｒｌａｌｃｏｈｏｌＣｏｎｉｆｅｒｌａｌｃｏｈｏｌ５５ｈｄｒｏｘｃｏｎｉｆｅｒｌａｌｃｏｈｏｌＳｉｎａｌａｌ－　　－羟基松柏醇：－　　－ｐｙｐｙｙｙｙｙｐｙ　；过氧化物酶／漆酶：／；Ｈ型木质素：ＨｃｏｈｏｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅｌａｃｃａｓｅｌｉｎｉｎ；Ｇ型木质素：Ｇｌｉｎｉｎ；Ｓ型木质素：Ｓｌｉｎｉｎ．　　　ｇｇｇ

其中Ｓ另外半纤维素、果胶和木聚糖的合成也减少，外层木质部表现出橙棕５０％，ｌｉｎｉｎ比Ｇｌｉｎｉｎ减少得更多，－－ｇｇ

９］

。Ｃ并且伴随着纤维素比例的增加，改善了制浆特性［木质色且着色不均，ＣＲ下调的烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）　

素含量降低，而Ｃ转录和代谢研究表明木质素合成途径与其他代ＡＤ下调植株的木质素中含有更多的醛类物质，

１０］

。玉米（，谢途径相关联［Ｚｅａ　ｍａｓ）ＣＣＲ１基因插入突变体（Ｚｍｃｃｒ１ＣＣＲ１基因的表达量只有野生型的３１％，－）ｙ

／其木质素含量有所下降且结构明显改变，并且消化性能提高，但未影响植Ｈ－ｌｉｎｉｎ含量明显下降，ＳＧ略有上升，ｇ

１１］

。另外，株的生长发育［由于苯丙氨酸代谢途径不仅生成木质素，还生成其他的植物次生代谢物，如类黄酮、羟

单宁酸等酚类化合物，因此，可通过降低木质素的生物合成来促进有益的可溶性酚类化合物生成。在基苯乙烯、

干扰Ｃ中，木质素含量降低，同时茎和叶中可溶性酚类物质的总ＣＲ基因的转基因番茄（Ｓｏｌａｎｕｍｌｃｏｅｒｓｉｃｕｍ）　ｙｐ组分分析显示绿原酸和芦丁等含量增加，果实中酚类物质总量没有增加，但是组分发生改变，相应地提含量增加，

１２］

。高了番茄提取物的抗氧化能力［

将３种肉桂醛（对－香豆醛、松柏醛和芥子醛）还原生成相应的３ＣＡＤ催化木质素单体生物合成的最后一步，

［３］

种肉桂醇。Ｓ通过Ｒ中Ｃ发现这些植株茎中催化松ａａｔｈｏｆｆ等１ＮＡｉ下调柳枝稷（Ｐａｎｉｃｕｍ　ｖｉｒａｔｕｍ）ＡＤ表达，ｇ

总木质素含量和表皮素含量也明显降低，且经过氢氧化铵预处理和纤维素酶消柏醛和芥子醛的ＣＡＤ活性下降，

［４］化的研磨样品释放出的葡萄糖也多于野生型对照。Ｆ利用Ｒ结果显示ｏｒｎａｌé等１ＮＡｉ下调玉米ＣＡＤ基因表达，

转基因植株细胞壁的成分发生变化，茎的细胞壁总木质素含量未受影响，在不同组织中ＣＡＤ下调的程度不同，／并且积累了更多的纤维素和木聚糖，而中脉的细胞壁总木质素含量和多糖含量下降，转基因ＳＧ比例稍有下降，植株与野生型相比表型没有改变，但更容易降解，乙醇产量也较高。Ｒ中的ＮＡｉ下调亚麻（Ｌｉｎｕｍ　ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）

１５］

。Ｒ木质素前体物质含量显著提高，木质素、果胶和半纤维素含量降低，转基因植株的弹性增加［ＣＡＤ后，ＮＡｉ［６］

。还有研究将拟南下调Ｃ植株生长发育正常，木质素含量未受影响，仅ＧＡＤ１的转基因烟草，ｌｉｎｉｎ略有减少１－ｇ

的突变体和Ｃ芥２种ＣＡＤ基因（ＣＡＤ　Ｃ和ＣＡＤ　Ｄ）ＣＲ１的突变体杂交后发现其木质素含量比野生型减少了

１７］

。木质素结构也发生改变，但植株严重矮化并伴有雄性不育症状［３１％，

综上所述，利用Ｒ在多种植物中，可以通过降低木质素合成途径中相应酶的表ＮＡｉ技术并结合转基因方法，达而获得木质素含量降低或者木质素组成改变的转基因植物。Ｒ在ｍＲＮＡｉ是由双链ＲＮＡ分子介导的、ＮＡ水平关闭相应基因表达的过程。因为Ｒ抑制基因表达效率高，，已被广泛应用于真核生物基因功ＮＡｉ技术简单易行，

１８］

。能的研究［

多年生黑麦草（是禾本科黑麦草属（植物，是优良的牧草和草坪草，但自交不亲和，Ｌｏｌｉｕｍ　ｅｒｅｎｎｅ）Ｌｏｌｉｕｍ）ｐ传统育种困难而复杂。随着现代生物技术的发展，转基因技术已成为黑麦草遗传改良的有力工具，可通过ＲＮＡｉ

４］

。方法和转基因技术获得木质素含量降低的黑麦草［

１９］

，本研究在本实验室已建立的多年生黑麦草转化体系上［优化转化方法，通过根癌农杆菌（Ａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇ

介导的Ｒ降低多年生黑麦草中Ｃ以期获得低木质素含量的多年生黑ＮＡｉ技术，ＣＲ、ＣＡＤ基因表达，ｔｕｍｅａｃｉｅｎｓ）ｆ为进一步培育高消化利用率的多年生黑麦草提供种质资源。麦草新材料，１　材料与方法１．１　材料

，多年生黑麦草品种“雅晴”由百绿草业公司惠赠。本实验在中国科学院成都生物研究所于２０１０年９月至２０１２年４月期间进行并完成。根癌农杆菌ＥＨＡ１０５由本实验室保存。植物表达载体ｐ２３５５由中国科学院成都生物研究所马欣荣实验室在ｐ外源基因由多克隆位点区插入；中间载体ｐｉｎｔ由四ＣＡＭＢＩＡ２３０１基础上构建，ＳＫ－川省农业科学院黄维藻博士惠赠。载体示意图见图２。１．２　ＣＡＤ和ＣＣＲ基因片段的分离克隆

））根据Ｎ登录号：和Ｃ登录号：基因ｃ选取其ＣＢＩ中的黑麦草ＣＡＤ（ＡＦ４７２５９１．１ＣＲ（ＡＦ２７８６９８．１ＤＮＡ序列，中约２应用Ｐ分别设计Ｃ反向目的片段的上下游２对引物（表００～３００ｂｒｉｍｅｒ６．０软件，ＡＤ和ＣＣＲ正、　ｐ的片段，），正向片段和反向片段引物的扩增序列相同，而酶切位点不同，以使目的片段定向插入载体中。１

预期Ｃ加酶切位点１共计２加酶切位点１共计ＡＤ片段长度２５６ｂ２ｂ６８ｂＣＣＲ片段长度１９４ｂ２ｂｐ，ｐ，ｐ；ｐ，ｐ，２０６ｂｐ。

第２２卷第５期草业学报２０１３年７５

图２　载体结构简图Ｆｉ．２　Ｔｈｅｃａｓｓｅｔｔｅｏｆｖｅｃｔｏｒｓ　　　ｇ

ｉｎｔ结构简图。ｐｉｎｔｓｉｍｌｉｆｉｅｄｄｉａｒａｍ．Ｂ：植物表达载体ｐｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｏｆｔｈｅｅｘｒｅｓＳＫＳＫ２３５５表达盒示意图。Ｔｌａｎｔ　Ａ：中间载体ｐ－－　　　　　　　　－ｐｇｐｐｐｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉＣＡＤ和ｐｉＣＣＲ干扰片段表达盒示意图。ＴｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉＣＡＤａｎｄｉＣＣＲｉｎ２３５５．Ｃ：重组植物表达载体ｐ２３２３ｌａｎｔ２３２３　　－－　　　　－　　－　－ｐｐｐｐｐｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｍｅｎｔｅｘｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｄｉａｒａｍ．　　　　ｇｐｇ　

表１　用于扩增Ｃ反向片段的寡核苷酸引物ＡＤ、ＣＣＲ正、

Ｔａｂｌｅ１　ＳｅｕｅｎｃｅｓｏｆｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＡＤ，ＣＣＲｆｒａｍｅｎｔｓ　　　　　　　　　ｑｇｐｐｇ

引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ　

ｃａｄ１－ｃａｄ２－ｃａｄ３－ｃａｄ４－ｃｃｒ１－ｃｃｒ２－ｃｃｒ３－ｃｃｒ４－

引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｓ　ｑ

ＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣ　ＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴ　ＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＣ　ＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＴ　ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣ　ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣ　ＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣ　ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣ　

酶切位点Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ　

扩增片段Ａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒａｍｅｎｔｓ　ｐｇ

ＢａｍＨＩ　　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＳａｃＩ　　ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ　　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＳａｃＩ　　ＥｃｏＲＩ　

）。Ｃ预期长度２ＣＡＤ正向片段（６８ｂＡＤｆｏｒ　－ｐ）ｗａｒｄｆｒａｍｅｎｔ（ｅｘｅｃｔｅｄｌｅｎｔｈ２６８ｂ．　　　ｇｐｇｐ。Ｃ预期长度２ＣＡＤ反向片段（６８ｂＡＤｒｅ　－ｐ））ｖｅｒｓｅｆｒａｍｅｎｔ（ｅｘｅｃｔｅｄｌｅｎｔｈ２６８ｂ．　　　ｇｐｇｐ。Ｃ预期长度２ＣＣＲ正向片段（０６ｂＣＲｆｏｒ　－ｐ））ｗａｒｄｆｒａｍｅｎｔ（ｅｘｅｃｔｅｄｌｅｎｔｈ２０６ｂ．　　　ｇｐｇｐ。Ｃ预期长度２ＣＣＲ反向片段（０６ｂＣＲｒｅ　－ｐ））ｖｅｒｓｅｆｒａｍｅｎｔ（ｅｘｅｃｔｅｄｌｅｎｔｈ２０６ｂ．　　　ｇｐｇｐ

　下划线部分为酶切位点。

ｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｉｔｅｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｍｅｓ．　Ｔ　　　　　　　ｙ

）用Ｒ反转录成ｃ作为扩增目的片段ＮＡ，Ｔ－ＰＣＲ试剂盒（ＴａＫａＲａＤＮＡ，　　提取新鲜的野生型黑麦草叶片总Ｒ

。扩增条件为的模板。用引物ｃ表１）ａｄ１和ｃａｄ２、ｃｃｒ１和ｃｃｒ２分别ＰＣＲ扩增出ＣＡＤ和ＣＣＲ的正向片段（－－－－；，，，（；。扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳，切下目９４℃５ｍｉｎ９４℃４５ｓ５５℃４５ｓ７２℃４５ｓ３５个循环）７２℃７ｍｉｎ（）上海生工）回收后与ｐ连接，筛选重组子并测序（上海的条带用ＤＮＡ　ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＴａＫａＲａＭＤ１９　　－Ｔ载体（，）生工）测序结果用Ｄ版本５．软件进行分析。ＮＡＭＡＮ（２．２

以含有Ｃ分别以ｃＡＤ或ＣＣＲ正向片段的重组ｐａｄ３和ｃａｄ４、ｃｃｒ３和ｃｃｒ４为引物，ＭＤ１９－Ｔ载体为模板，－－－－，表１）再分别克隆到ｐ筛选重组子，酶切验证并测序分ＰＣＲ扩增出ＣＡＤ和ＣＣＲ的反向片段（ＭＤ１９－Ｔ载体中，析。

１．３　ｐｉＣＡＤ和ｐｉＣＣＲ植物表达载体构建２３２３－－

含有正向目的片段的重组ｐ分别回收小片段，与经相同酶ＭＤ１９ａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ双酶切，－Ｔ载体分别经Ｂ　　切的中间载体ｐ筛选重组子并酶切验证。再将含Ｃｉｎｔ连接，ＡＤ或ＣＣＲ反向片段的重组ｐＳＫＭＤ１９－－Ｔ载体分别用Ｅ回收小片段分别插入已经含有Ｃ筛ｃｏＲＩ和ＳａｃＩ双酶切后，ＡＤ或ＣＣＲ正向片段的重组中间载体相应位点，　酶切验证。分别获得含有干扰片段的中间载体ｐ具有发卡结构的干扰片段分选重组子，ｉＣＡＤ和ｐｉＣＣＲ，ＳＫＳＫ－－别称为ｉＣＡＤ和ｉＣＣＲ。

将重组中间载体分别用Ｂ分别获得ｉａｍＨＩ和ＳａｃＩ双酶切后，ＣＡＤ或ｉＣＣＲ目的片段。将目的片段分别插　　

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