过表达AtTIP和AtNHX基因对拟南芥耐盐性的影响

发布时间：2017-10-29 19:01

  本文关键词：过表达AtTIP和AtNHX基因对拟南芥耐盐性的影响

  更多相关文章： 拟南芥 Na~+/H~+逆向转运蛋白 液泡膜水孔蛋白 盐胁迫 耐盐性

【摘要】：通过基因工程手段培育耐盐作物是开发盐碱地的重要途径,前人及本实验室的前期研究发现,耐盐性较强的真盐生植物在盐渍条件下Na+/H+逆向转运蛋白和液泡膜水孔蛋白的基因表达量均显著升高。因此,推测这两类基因可能都参与了植物的盐胁迫响应。本文通过在拟南芥中过表达1个液泡膜水孔蛋白(tonoplast intrinsic proteins,At TIP1-1)和2个Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+exchanger,At NHXs)基因,比较了它们在植物耐盐性中的作用,研究结果如下。1 At NHX1、At NHX2、At TIP1-1基因克隆及拟南芥转化利用RT-PCR方法克隆At TIP1-1、At NHX1和At NHX2基因CDS序列。以p CAMBIA-35s-OCS和p Cambia1300-221-HA-MYC为载体骨架,构建基因过量表达载体,然后将构建的表达载体在农杆菌介导下利用浸渗花蕾法转化拟南芥。对卡那霉素抗性和潮霉素抗性的植株利用PCR检测和荧光定量PCR方法检测发现转基因植株均可正常转录表达目的基因。2转基因拟南芥在不同盐浓度下的形态分析当转基因拟南芥和野生型萌发至两天时,分别转移到含有0、50、100、150和200 m M Na Cl的MS方板培养基上。待长至7天后,发现转At NHX1和At NHX2的拟南芥株系在100-200 m M Na Cl浓度下,长势均好于野生型。而转At TIP1-1的拟南芥株系在150-200 m M Na Cl下长势均不如野生型,即表现出盐敏感。而其它盐浓度下转基因植株和野生型并没有明显区别。3转基因拟南芥在盐处理下的生理生化分析当转基因拟南芥生长至6叶期时,用100 m M和200 m M Na Cl进行盐处理,两周之后,测定叶绿素荧光、叶绿素含量、植株鲜重以及蛋白质含量等生理指标。结果也显示,转At NHX1和At NHX2的拟南芥株系盐处理后整株鲜重、叶绿素含量和叶片光合活性均高于野生型,耐盐性显著提高,说明这两个基因均在拟南芥耐盐性中具有重要作用。而单独过表达At TIP1-1不能提高拟南芥的耐盐性,甚至使拟南芥对盐胁迫更敏感,说明液泡膜水孔蛋白参与植物耐盐性可能是与NHX基因协同作用的,二者的协同作用将在今后的工作中进一步证明。
【关键词】：拟南芥 Na~+/H~+逆向转运蛋白 液泡膜水孔蛋白 盐胁迫 耐盐性
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩略词6-9
• 第1章 文献综述9-17
• 1.1 盐碱地开发利用方式与植物耐盐性9
• 1.2 植物的耐盐机制9-11
• 1.2.1 Na~+区域化与植物耐盐性10
• 1.2.2 Na~+/ K~+平衡与植物耐盐性10
• 1.2.3 渗透保护物质积累与植物耐盐性10
• 1.2.4 抗氧化能力与植物耐盐性10-11
• 1.3 耐盐性研究存在的问题及解决方案11-16
• 1.3.1 真盐生植物的特征11-12
• 1.3.2 真盐生植物耐盐的分子机制12
• 1.3.3 Na~+/H~+逆向转运蛋白与水孔蛋白简介12-13
• 1.3.4 Na~+/H~+逆向转运蛋白与水孔蛋白的基本结构13
• 1.3.5 Na~+/H~+逆向转运蛋白与水孔蛋白的表达模式13-15
• 1.3.6 Na~+/H~+逆向转运蛋白与水孔蛋白的功能15-16
• 1.4 展望16-17
• 第2章 材料与方法17-24
• 2.1 实验材料17
• 2.1.1 植物材料17
• 2.1.2 质粒载体及菌种17
• 2.1.3 主要分子生物学试剂17
• 2.2 实验方法17-24
• 2.2.1 核酸提取17-18
• 2.2.2 TIP1-1、NHX1及NHX2的克隆18-20
• 2.2.3 拟南芥超表达载体构建20-21
• 2.2.4 转化拟南芥21
• 2.2.5 转基因拟南芥筛选21
• 2.2.6 PCR检测转基因植株21
• 2.2.7 转基因植株的目的基因拷贝数的检测21
• 2.2.8 转基因植株在不同盐浓度处理下的幼苗期形态分析21-22
• 2.2.9 转基因植株在盐胁迫下的叶绿素荧光动力学分析22
• 2.2.10 转基因拟南芥在盐处理下鲜重的测定22
• 2.2.11 转基因拟南芥在盐处理下叶绿素含量的测定22-23
• 2.2.12 转基因拟南芥在盐处理下蛋白质含量的测定23-24
• 第3章 结果与分析24-41
• 3.1 拟南芥TIP1-1、NHX基因编码区克隆及转基因载体构建24-25
• 3.1.1 拟南芥总RNA提取及检测24
• 3.1.2 三种基因克隆及测序24-25
• 3.2 表达载体构建25-26
• 3.2.1 PMD18-T-基因以及空载体的双酶切25
• 3.2.2 菌落PCR及双酶切检测25
• 3.2.3 农杆菌菌落PCR25-26
• 3.3 转基因植株筛选26-27
• 3.4 转基因拟南芥PCR检测27-30
• 3.4.1 转基因植株的PCR验证27-28
• 3.4.2 转基因植株拷贝数的验证28-29
• 3.4.3 目的基因在转基因拟南芥中的表达量29-30
• 3.5 盐处理对转基因拟南芥的影响30-41
• 3.5.1 盐处理对转基因拟南芥幼苗的影响30-34
• 3.5.2 正常条件和盐处理下对转基因拟南芥的形态影响变化34-35
• 3.5.3 盐处理对转基因拟南芥叶绿素荧光动力学的影响35-36
• 3.5.4 盐处理对转基因拟南芥鲜重的影响36-37
• 3.5.5 盐处理对转基因拟南芥叶绿素含量的影响37-38
• 3.5.6 盐处理对转基因拟南芥蛋白质含量的影响38-41
• 第4章 讨论41-44
• 4.1 转基因拟南芥在不同盐处理下的幼苗形态分析41-42
• 4.2 转基因拟南芥在盐处理下的生理生化分析42-44
• 4.2.1 转基因拟南芥在低盐浓度下的生理分析42-43
• 4.2.2 转基因植株在高盐浓度下的生理分析43-44
• 第5章 结论与展望44-45
• 参考文献45-52
• 致谢52-53
• 在读期间发表的学术论文及研究成果53

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 刘倩;过表达AtTIP和AtNHX基因对拟南芥耐盐性的影响[D];曲阜师范大学;2016年

，

本文编号：1114227