滇重楼糖基转移酶基因及细胞色素P450基因的表达研究

发布时间：2017-10-31 06:14

  本文关键词：滇重楼糖基转移酶基因及细胞色素P450基因的表达研究

  更多相关文章： 滇重楼 细胞色素P450 糖基转移酶 表达研究

【摘要】：目的滇重楼植物为云南省道地药材,是云南白药、宫血宁胶囊等著名中成药的主要原料之一,具有极高的经济价值和市场前景。而细胞色素P450酶及糖基转移酶都是甲羟戊酸途径上对滇重楼主要有效成分--甾体皂苷合成具有重要作用的酶。本文通过研究滇重楼植物的糖基转移酶基因及细胞色素P450基因,为后续人工调控滇重楼次生代谢的生物合成研究奠定基础。方法1、克隆技术,通过滇重楼c DNA文库中分析并获取的滇重楼植物的P450基因及糖基转移酶基因序列,通过该序列设计引物。提取滇重楼植物RNA反转录形成第一链c DNA作为模板,进行PCR,获取该序列的全长。将PCR产物纯化连入克隆载体,转化进入Trans1-T1大肠杆菌细胞,菌落PCR验证测序并保存。2、原核表达技术,构建表达载体,转化Trans1-T1大肠杆菌细胞进行大量表达,进行菌落PCR及测序,质粒提取,转化Trans BL21(DE3)表达大肠杆菌,诱导表达,提取其总蛋白,SDS-PAGE电泳验证蛋白表达结果。3、实时荧光定量PCR,对滇重楼植物的根茎、茎、叶三个部分分别进行RNA的提取,反转录各自形成第一链c DNA,选择Actin1n基因作为内参基因,设计引物进行实时荧光定量PCR,分析实验结果。4、真核表达系统构建,构建p PIC9K-P450载体,转入TOP10大肠杆菌进行大量制备,提取质粒。制备GS115酵母感受态细胞,转化,PCR鉴定实验结果。结果获取滇重楼植物的糖基转移酶基因序列全长为870bp,通过生物信息学分析糖基转移酶基因编码289个氨基酸,产生蛋白质分子量为31532.6D,理论等电点为5.63,为一个疏水性蛋白。与无油樟植物的糖基转移酶基因具有较高的同源性,具有一个跨膜区域。成功构建糖基转移酶基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE电泳显示在31.5k D处具有特异性蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,糖基转移酶基因在滇重楼植物中根茎和叶的表达量相近,超过在茎中的表达量的两倍。获取滇重楼植物的细胞色素P450基因序列全长为1518bp,通过生物信息学分析细胞色素P450基因编码505个氨基酸,产生蛋白质分子量为57735.2D,理论等电点为7.68,为一个亲水性蛋白。与海枣、油棕植物的细胞色素P450基因具有较高的同源性,具有一个跨膜区域,成功构建细胞色素P450基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE电泳显示在57.7k D处具有特异性蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,细胞色素P450基因在滇重楼植物的根茎中的表达量最高,超过在茎和叶中的表达量的两倍,茎和叶中的表达量相近。并成功构建细胞色素P450的真核表达系统。结论本文成功克隆出滇重楼植物的糖基转移酶基因及细胞色素P450基因的全长,并成功构建了两个基因的原核表达系统,为今后滇重楼植物其他途径的糖基转移酶基因及细胞色素P450研究提供了一定方法及依据。成功构建细胞色素P450基因的真核表达系统,为其他基因在真核细胞中的表达研究提供参考。荧光定量PCR结果显示,两个基因在用药部位根茎中的表达量均为最高,为后续两个基因对滇重楼植物有效成分合成影响研究提供一定的研究依据。
【关键词】：滇重楼 细胞色素P450 糖基转移酶 表达研究
【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词11-12
• 前言12-15
• 第一章 糖基转移酶基因的克隆原核表达及实时荧光定量PCR分析15-39
• 1 引言15-16
• 2 材料与方法16-26
• 2.1 实验材料16-18
• 2.2 实验方法18-26
• 3 结果与分析26-37
• 3.1 克隆26-28
• 3.2 原核表达28-29
• 3.3 荧光定量29-32
• 3.4 糖基转移酶基因的生物信息学分析32-37
• 4 结论37-39
• 第二章 P450基因的克隆原核表达、实时荧光定量RCR及真核表达构建39-62
• 1 引言39
• 2 材料与方法39-47
• 2.1 实验材料39-42
• 2.2 实验方法42-47
• 3 结果与分析47-60
• 3.1 克隆47-48
• 3.2 原核表达48-49
• 3.3 荧光定量PCR49-53
• 3.4 真核表达体系构建结果分析53-54
• 3.5 生物信息学分析54-60
• 4 结论60-62
• 文献综述62-72
• 参考文献72-75
• 附录75-83
• 硕士期间研究成果83-84
• 致谢84

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赵庭周;;滇重楼可持续采收方法初探[J];中国野生植物资源;2012年01期

2 陈昌祥,连红兵,李运昌,周俊;滇重楼种子中的甾体皂甙[J];云南植物研究;1990年04期

3 王德贵;;滇重楼栽培管理技术[J];民营科技;2014年05期

4 陈昌祥,周俊;滇产植物皂素成分的研究 Ⅴ.滇重楼的甾体皂甙和β-蜕皮激素[J];云南植物研究;1981年01期

5 李运昌;滇重楼的无性繁殖[J];云南植物研究;1986年04期

6 李运昌;重楼属植物引种栽培的研究 Ⅱ.滇重楼的育苗试验[J];云南植物研究;1986年02期

7 王世林,周立刚,李英,蔡妙英;滇重楼寄生菌的研究[J];微生物学报;1999年02期

8 ;滇重楼优良品种选育及三段栽培法研究与示范取得突破性进展[J];云南科技管理;2010年02期

9 王世林，赵永灵，李晓玉，，李运昌，李恒;粉质和胶质滇重楼的研究[J];云南植物研究;1996年03期

10 谭伟;戴建辉;熊勇;杨敏;王红斌;;滇重楼皂苷提取及含量测定[J];云南民族大学学报(自然科学版);2010年02期

中国重要会议论文全文数据库 前7条

1 王世林;许云龙;;滇重楼研究进展[A];西部地区第二届植物科学与开发学术讨论会论文摘要集[C];2001年

2 黄玮;孟繁蕴;张文生;崔晓星;王永炎;;滇重楼种子休眠机理研究[A];全国第8届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2008年

3 孟繁蕴;邓子超;张文生;王永炎;;滇重楼种胚休眠和发育过程中内源激素变化的研究[A];2006海峡两岸暨CSNR全国第七届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2006年

4 曹晓冬;周立刚;李静;徐利剑;赵江林;;滇重楼内生真菌及其甾体化合物初步研究[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年

5 康利平;余河水;刘奕训;赵阳;熊呈琦;谭大维;Kate Yu;高月;马百平;;利用UPLC/oa-TOF MS~E快速分析鉴定滇重楼的化学成分[A];中国化学会第八届天然有机化学学术研讨会论文集[C];2010年

6 裴卫华;曹继芬;杨明英;李向东;孙道旺;李绍平;赵志坚;;滇重楼一种茎腐新病害病原的分离鉴定[A];中国植物病理学会2011年学术年会论文集[C];2011年

7 孟繁蕴;张文生;韩建萍;冯成强;张义玲;王永炎;;滇重楼种胚发育和休眠与种子内源激素关系的研究[A];全国第二届中药资源生态学学术研讨会论文集[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 本报记者 陈泽;滇重楼种植走向规模化规范化[N];云南政协报;2013年

2 记者 熊燕;滇重楼种子快速萌发有新突破[N];云南日报;2014年

3 巍山县农业局 沈嘉彬;滇重楼栽培管理[N];云南科技报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 高成杰;滇重楼生物量分配与环境调控机制研究[D];中国林业科学研究院;2015年

2 李焘;滇重楼与七叶一枝花化学成分及生物活性的研究[D];陕西师范大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 夏从芳;滇重楼内生真菌杂色曲霉发酵产物中丁内酯类化合物的研究[D];云南民族大学;2015年

2 谈文状;滇重楼抗肿瘤活性成分研究[D];昆明理工大学;2015年

3 陆俊锟;滇重楼巴布剂治疗急性痛风性关节炎的临床研究[D];云南中医学院;2016年

4 董栩;滇重楼糖基转移酶基因及细胞色素P450基因的表达研究[D];云南中医学院;2016年

5 许燕;滇重楼SE、HMGR和FPS基因的克隆及原核表达研究[D];云南中医学院;2016年

6 刘晓萌;栽培滇重楼的分子鉴别及质量评价[D];云南中医学院;2014年

7 王进波;滇重楼鲨烯合酶和环阿屯醇合酶的基因克隆与序列分析[D];四川农业大学;2012年

8 王羽;滇重楼抗肿瘤活性成分的研究[D];天津大学;2007年

9 徐文娟;滇重楼种子发育与种子休眠解除机理研究[D];北京协和医学院;2013年

10 李静;滇重楼内生真菌及其抗菌活性检测和甾体化合物分析[D];四川农业大学;2007年

本文编号：1121122