应用16S rRNA基因测序技术初步分析院内获得性铜绿假单胞菌肺炎患者肺内菌群

发布时间：2017-10-31 15:00

  本文关键词：应用16S rRNA基因测序技术初步分析院内获得性铜绿假单胞菌肺炎患者肺内菌群

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【摘要】：目的:运用16S rRNA基因测序技术分析神经外科重症监护室(Neurosurgical Intensive Care Unit,NICU)铜绿假单胞菌性院内获得性肺炎(Hospital Acquired Pneumonia,HAP)患者感染前和感染时肺内细菌群落结构和功能的变化,为HAP的诊断和治疗提供新的理念和思路。方法:对自2013年12月至2015年12月NICU住院患者按如下条件进行筛选:1)入院时不合并肺损伤且无肺炎的中重型脑损伤个体;2)入院48小时内行气管切开;3)入院48小时后无HAP下利用纤维支气管镜经气管切口采集标本,细菌培养结果提示阴性;4)首次出现HAP的标本细菌培养结果仅提示铜绿假单胞菌,连着2次及以上培养结果均仅提示铜绿假单胞菌。将近期有抗生素使用史,不适合做纤维支气管镜的,第二次标本未取到或培养结果非铜绿假单胞菌或合并其他病原菌的个体去除。根据标本采集时是否存在HAP将标本分为感染前组和感染组,标本采集后分为两份,一份送检验科行细菌培养,一份直接低温冻存为高通量测序做准备。临床信息收集包括流行病学资料,临床症状及体征、化验结果和影像学检查结果等。从群落结构和功能分析铜绿假单胞菌感染性HAP患者感染前和感染时的菌群结构和功能变化。结果:本项研究共纳入来自10例患者自身对照的20份样本,每例患者感染前和感染时各1份样本,感染前组和感染组分别含有10份样本。我们将从不同分类水平、β多样性、主成分分析、α多样性和功能基因5个角度对结果进行分析统计。1)属水平共有459种菌群,感染前组的优势菌群为嗜血杆菌属、普氏菌属、链球菌属和奈瑟氏菌属,在感染前组和感染组的含量分别为:25.0%vs 0.8%、21.0%vs 0.8%、12.7%vs 5.1%、9.0%vs 12.9%;感染组优势菌为普氏菌属、假单胞菌属、奈瑟氏菌属、单食胞菌属,在感染组和感染前组的含量分别为24.4%vs 21.0%、20.2%vs 0.3%、12.9%vs 9.0%、6.3%vs 0.02%。同一个体感染前和感染时菌群共有率较低,均低于60%。459种菌群中的25种分布存在统计学差异,包括优势菌群:假单胞菌属、嗜血杆菌属;2)科水平共有289种菌群,感染前组优势菌群为巴斯德氏菌科,链球菌科,普雷沃氏菌科,在感染前组和感染组的含量分别为27.95%vs1.34%、12.65%vs 5.11%、11.39%vs 11.82%;感染组优势菌为假单胞菌科,奈瑟氏菌和Paraprevotellaceae,在感染前组和感染组的含量分别为20.24%vs 0.31%、13.78%vs 9.28%、12.58%vs 9.62%。289种菌群中有15种菌群存在统计学差异,包括优势菌群:巴斯德氏菌科,假单胞菌科。3)目水平共有172种菌群,感染前组优势菌群为巴斯德氏菌目,拟杆菌目,乳酸杆菌目,在感染前组和感染组的含量分别为27.95%vs 1.34%,24.33%vs 28.66%,13.87%vs 5.38%。感染组优势菌为拟杆菌目,假单胞菌目,奈瑟氏菌目,在感染前组和感染组的含量分别为28.66%vs 24.33%,23.28%vs 0.58%,13.78%vs9.28%。172种菌群中8种菌群存在统计学差异,包括优势菌群:巴斯德氏菌目和假单胞菌目。4)纲水平共有87种菌群,感染前优势菌群为γ变形菌纲,拟杆菌纲,芽孢杆菌纲,在感染前组和感染组的含量分别为33.39%vs 31.34%,24.33%vs 28.66%,14.87%vs 5.67%。感染组优势菌为γ变形菌纲,拟杆菌纲,β变形菌纲,在感染前组和感染组的含量分别为31.34%vs 33.39%,28.66%vs 24.33%,14.48%vs 10.03%。87种菌群中仅有3种菌群存在统计学差异不包括优势菌群。5)在门水平上两组共有37种菌群,变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门是两组共同的优势菌群,在感染前组和感染组的含量分别为44.8%vs 46.5%,26.4%vs30.6%,18.7%vs 12.1%。37种菌群中只有2种存在统计学差异不包括优势菌群。同一个体感染前和感染时菌群共有率最低为39.1%,最高为88.9%,10个自身对照匹配组中只有1组共有率为39.1%,其余均在60%以上。6)β多样性分析和属水平主成分分析利用样品之间菌群的进化信息以及菌群的丰度信息,进行Unifrac分析,得到样品间差异的距离矩阵信息,进行PCo A分析和NMDS分析以及应用R软件对属水平上的分类及菌群丰度进行主成分分析,均发现相同个体感染前和感染时、感染前组和感染组组间及组内样本间距离较远,说明菌群组成差异性较大。7)α多样性指标Chao指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数反映群落多样性和丰富度的α多样性指标在两组间分布无显著统计学差异。8)各样本中群落功能基因共包括7大类和41小类,其中环境和信息处理中的膜转运、遗传信息处理中的复制和修复、新陈代谢中的糖代谢和氨基酸代谢为感染前组和感染组的共同优势功能基因,比例分别为11.2%、9.7%、9.4%、9.1%和10.1%、8.5%、8.9%、10.1%。41种功能基因中8种存在统计学差异,其中包括氨基酸代谢相关基因。结论:1、感染前组和感染组分析发现:1)菌群组成在属、科、目水平上存在明显差异,尤其是优势菌分布,在纲和门水平上差异较小;2)两组间菌群进化信息及丰度信息存在明显差异;3)功能基因分布差异性较小。2、相同个体感染前和感染时标本分析发现:1)菌群组成在属、科、目、纲水平上存在明显差异,尤其是优势菌群种类及含量,在门水平上差异较小;2)两标本间菌群进化信息及丰度信息存在明显差异;3)功能基因分布差异性较小。3、不同个体标本在感染前组和感染组组内分析发现:组内各样本菌群在各分类水平上均存在明显差异,功能基因及丰度差异性较小。4、该研究成果初步展示了中重度颅脑损伤患者在NICU治疗期间,铜绿假单胞菌性HAP发生前和感染时肺内菌群结构发生了根本性变化,为今后HAP的诊断及治疗提供了理论基础与依据。
【关键词】：16S rRNA 基因 院内获得性肺炎 铜绿假单胞杆菌 神经外科重症监护室
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 1.实验对象16-18
• 1.1 实验对象16
• 1.2 实验分组16
• 1.3 样本编号规则16
• 1.4 院内获得性肺炎诊断标准16
• 1.5 病原学诊断标准16
• 1.6 入组标准和排除标准16-18
• 2.实验方法18-24
• 2.1 样本采集18
• 2.2 传统的样本中病原学诊断技术18-19
• 2.3 16S rRNA基因测序技术19-22
• 2.3.1 宏基因组(Metagenome)19
• 2.3.2 技术路线19-20
• 2.3.3 数据分析流程20-22
• 2.4 临床信息采集22-23
• 2.5 统计分析23-24
• 3.实验结果24-57
• 3.1 基本信息24
• 3.2 结果分析流程24-30
• 3.2.1 有效序列24
• 3.2.2 优质序列24-28
• 3.2.3 优质序列的长度分析28-29
• 3.2.4 OTU聚类及注释29-30
• 3.3 基于菌群丰度分析30-32
• 3.3.1 稀释曲线30-31
• 3.3.2 α多样性分析31-32
• 3.4 基于群落结构分析32-48
• 3.4.1 样品群落组成分析32-33
• 3.4.2 门水平33-45
• 3.4.3 属水平45-48
• 3.5 含进化关系的菌群丰度分布48-49
• 3.6 β多样性分析49-51
• 3.7 主成分分析51-52
• 3.8 聚类分析52-53
• 3.9 群落功能基因预测53-57
• 4.讨论57-62
• 结论62-63
• 参考文献63-68
• 发表论文和参加科研情况说明68-69
• 综述 浅谈16S rRNA基因测序技术与传统细菌培养技术在院内获得性肺炎病原菌诊断中的应用69-79
• 综述参考文献76-79
• 致谢79-80
• 个人简历80

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本文编号：1122535