农杆菌介导的GmWRKY70基因转化大豆的研究

发布时间：2017-11-02 03:31

  本文关键词：农杆菌介导的GmWRKY70基因转化大豆的研究

  更多相关文章： 大豆 GmWRKY70 农杆菌介导法 T-DNA整合位点

【摘要】：大豆是重要的经济和油料作物,也是植物蛋白、脂类、矿物质和维生素等物质的天然资源,可供粮用、油用和饲用。近年来,国内粮食作物田间收益不断增加,使得农田收益较小的大豆种植面积进一步萎缩,国内大豆的供需均衡在一定程度上依赖国际市场,使我国面临严重的产业危机。大豆在生长过程中很容易受到逆境胁迫的影响,遭遇胁迫时产量往往会大幅度锐减乃至绝收,因此许多科研工作者运用传统育种方法和转基因技术培育新品种来增加大豆单产水平,同时运用转基因技术培育抗逆新品种使之适应不同生长环境(如盐碱、低温、冻害、干旱等),就可在保障主粮栽培区域不减少的情况下扩大大豆栽培。这对增加农民田间收益和国内大豆产量、以及确保国家食品战略安全等都意义重大。以5种不同基因型大豆为试验材料,初步探索出耐盐大豆的简易鉴定方法：在大豆植株长至两叶一心期时,分别进行0、150 mmol/L盐浓度处理,7d后进行农艺性状观察,其植株株高、植株地上部分生物量的相对差异以及盐处理10d后的植株萎蔫率均可作为筛选耐盐大豆的主要参考指标。以大豆品种‘东农50'为受体材料,采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法,将耐逆相关GmWRKY70基因导入到大豆基因组中,以期望获得可以稳定遗传的抗旱耐盐大豆新种质。同时,对转化得到的转基因种质,运用反向PCR技术进行T-DNA整合位点分析。主要结果如下：1、农杆菌介导的GmWRKY70基因的遗传转化。以大豆品种‘东农50'的子叶节为受体材料,通过农杆菌介导的子叶节法对植物表达载体pFGC5941-GmWRKY70进行遗传转化。转基因株系L-05和L-08经除草剂草丁膦喷施筛选、筛选标记Bar基因的PCR检测、目的基因GmWRKY70的PCR检测、以及载体构建特异性PCR检测等,初步确定GmWRKY70已经成功地整合到了大豆基因组中。2、基于反向PCR技术的T-DNA整合位点分析。利用反向PCR技术对以上获得的L-05和L-08两个转基因株系T-DNA整合位点侧翼的大豆染色体上的未知序列进行扩增。序列对比分析和进一步的T-DNA整合位点的PCR验证表明：L-05株系T-DNA区域正向整合在大豆基因组的第10染色体40,530,783 bp之后,L-08株系T-DNA区域正向整合在大豆基因组的第13染色体35,524,968 bp之后。
【关键词】：大豆 GmWRKY70 农杆菌介导法 T-DNA整合位点
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S565.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 文献综述11-23
• 1.1 WRKY家族转录因子的研究进展12-17
• 1.1.1 WRKY转录因子概述12-13
• 1.1.2 WRKY转录因子的结构特点13-14
• 1.1.2.1 WRKY结构域13-14
• 1.1.2.2 WRKY蛋白与W盒14
• 1.1.3 WRKY转录因子的生物学功能14-16
• 1.1.3.1 WRKY转录因子对生物胁迫的响应14-15
• 1.1.3.2 WRKY转录因子对非生物胁迫的响应15-16
• 1.1.3.3 WRKY转录因子在植物生长发育中的响应16
• 1.1.4 大豆WRKY转录因子研究进展16-17
• 1.2 大豆遗传转化方法研究17-19
• 1.2.1 农杆菌介导法17-18
• 1.2.2 基因枪法18
• 1.2.3 电击法18
• 1.2.4 聚乙二醇法18-19
• 1.2.5 花粉管通道法19
• 1.3 农杆菌介导大豆遗传转化的主要影响因素19-21
• 1.3.1 基因型的选择19-20
• 1.3.2 农杆菌菌株的选择20
• 1.3.3 筛选标记基因的选择20-21
• 1.4 转基因大豆的食用和环境安全性研究21-23
• 2 大豆植株耐盐简易鉴定方法探索23-31
• 2.1 材料与方法23-24
• 2.1.1 试验材料23
• 2.1.2 试验方法23-24
• 2.2 结果与分析24-29
• 2.2.1 盐胁迫对不同大豆基因型植株高度的影响24
• 2.2.2 盐胁迫对不同大豆基因型主根长度的影响24-25
• 2.2.3 盐胁迫对不同大豆基因型植株鲜重的影响25-27
• 2.2.4 盐胁迫对不同大豆基因型植株干重的影响27-29
• 2.2.5 盐胁迫对不同大豆基因型萎蔫率的影响29
• 2.3 讨论29-31
• 3 GmWRKY70基因的遗传转化与转基因植株的鉴定筛选31-44
• 3.1 材料与方法31-38
• 3.1.1 材料32-34
• 3.1.1.1 植物材料32
• 3.1.1.2 主要化学试剂及药品溶液配制32-33
• 3.1.1.3 培养基配方33-34
• 3.1.1.4 主要仪器设备34
• 3.1.2 方法34-38
• 3.1.2.1 种子消毒34
• 3.1.2.2 种子萌发34-35
• 3.1.2.3 共生菌制备35
• 3.1.2.4 外植体的制备和共培养35
• 3.1.2.5 抗性芽的诱导35-36
• 3.1.2.6 丛生芽的伸长36
• 3.1.2.7 生根培养36
• 3.1.2.8 植株的驯化与移栽36-37
• 3.1.2.9 DNA提取与PCR检测37-38
• 3.2 结果与分析38-41
• 3.2.1 大豆的遗传转化38-39
• 3.2.2 转基因大豆幼苗的草丁膦抗性筛选39
• 3.2.3 转基因大豆的分子检测39-41
• 3.3 讨论41-44
• 4 基于反向PCR技术的T-DNA整合位点分析44-54
• 4.1 材料与方法44-47
• 4.1.1 材料44-45
• 4.1.2 大豆基因组DNA的提取45
• 4.1.3 反向PCR引物设计与酶切位点选择45-46
• 4.1.4 DNA的酶切和酶切片段的环化46
• 4.1.5 两轮巢式反向PCR扩增与产物克隆测序46
• 4.1.6 序列对比分析46-47
• 4.1.7 T-DNA整合位点验证47
• 4.2 结果与分析47-52
• 4.2.1 反向PCR扩增47-48
• 4.2.2 基于反向PCR的T-DNA整合位点分析48-50
• 4.2.3 T-DNA整合位点的PCR验证50-52
• 4.3 讨论52-54
• 参考文献54-69
• 附录A 缩写词69-71
• 攻读学位期间取得的研究成果71-73
• 致谢73-75

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