恶臭假单胞菌KT2442类脂A结构多样性及相关基因研究

发布时间：2017-11-02 06:04

  本文关键词：恶臭假单胞菌KT2442类脂A结构多样性及相关基因研究

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【摘要】：重要工业生产菌株恶臭假单胞菌是革兰氏阴性菌,其细胞表层分布大量脂多糖分子,对细胞的生长和代谢调控起着重要作用;但这些脂多糖分子的精细结构目前未见报道。本论文利用生物化学、分析化学和分子生物学技术,对恶臭假单胞菌KT2442细胞表层类脂A分子结构多样性进行了研究,并鉴定了相关基因功能。主要研究结论如下:(1)从恶臭假单胞菌KT2442细胞膜中提取纯化脂质分子,并通过TLC、HPLC和ESI/MS/MS分析,确定了恶臭假单胞菌KT2442细胞膜中的磷脂组分和类脂A结构。磷脂中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、心磷脂的含量分别为79.9%、12.7%和7.4%;磷脂脂肪酸链组成主要为C16:1和C18:1。恶臭假单胞菌KT2442中至少存在六种不同的类脂A分子结构,脂肪酸链组成主要为C_(10)和C_(12)。(2)鉴定了KT2442染色体上的基因PP_0737和PP_3154均编码类脂A的脱酰基化酶,能够去除类脂A分子3位上的脂肪酸链,因而将这两个基因分别命名为pag L1和pag L2。首先通过在大肠杆菌W3110和HW001中进行异源表达,初步鉴定这两个基因均能编码脱酰基化酶;接着在KT2442中构建pag L1和pag L2的单敲除和双敲除突变株,进一步确定了这两个基因在KT2442中能够编码脱酰基化酶;最后在双敲除突变株中进行了这两个基因的回补表达,验证这两个基因都能编码脱酰基化酶。(3)系统研究了不同培养环境对pagL1和pagL2转录及类脂A脱酰基化的影响。将KT2442在不同温度、二甲苯浓度、锌离子浓度、镁离子浓度、p H条件下进行培养。pag L1的转录水平在高浓度锌离子和高浓度的镁离子条件下发生下调;pag L2的转录水平在高浓度二甲苯、高浓度锌离子、低浓度的镁离子条件下发生了上调;另外温度和锌离子主要影响了Pag L1和Pag L2的酶活。脱酰基化水平随着温度和二甲苯浓度的升高而升高,随着锌离子浓度和镁离子浓度的升高而降低。(4)系统研究了Pho P-Pho Q和ColR-ColS双组份调控系统在不同环境条件下对pagL1和pag L2的影响。将两个调控系统的敲除突变株在不同二甲苯浓度、锌离子浓度和镁离子浓度条件下进行培养。Pho P-Pho Q在高镁和低镁条件下均上调类脂A的脱酰基化水平;Col R-Col S在LB条件和高镁离子条件下轻微下调了脱酰基化水平;Col R-Col S在二甲苯存在时上调了脱酰基化酶的整体水平;在低镁离子条件下,Col R-Col S对于类脂A脱酰基化调控规律不定。(5)初步研究发现恶臭假单胞菌KT2442染色体上的基因PP_2423和PP_4570能编码类脂A的双加氧酶,该酶能够在2位次级脂肪酸链上添加一个3-OH,因而将这两个基因命名为lpx O1和lpx O2。PP_1735能够编码类脂A的脂肪酸转移酶,能够在2’位上添加一条C_(12)的次级脂肪酸链,因而将这个基因命名为lpx L2;初步鉴定PP_0024能够编码类脂A的磷酸乙醇胺转移酶,能在1或者4’位的磷酸基团上添加磷酸乙醇胺,因而将这个基因命名为eptA。
【关键词】：恶臭假单胞菌KT2442 磷脂 类脂A 类脂A脱酰基化酶 类脂A双加氧酶 类脂A脂肪酸转移酶
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 绪论9-19
• 1.1 革兰氏阴性菌膜壁脂质结构9-16
• 1.1.1 革兰氏阴性菌的磷脂9-11
• 1.1.2 大肠杆菌脂多糖和类脂A的合成途径11-12
• 1.1.3 类脂A的结构多样性12-15
• 1.1.4 类脂A的调控15-16
• 1.2 恶臭假单胞菌KT244216-17
• 1.3 立题依据和研究意义17
• 1.4 研究内容17-19
• 第二章 材料与方法19-30
• 2.1 实验材料与仪器设备19-23
• 2.1.1 菌株和质粒19-20
• 2.1.2 主要引物20-21
• 2.1.3 培养基和培养条件21-22
• 2.1.4 工具酶和试剂22
• 2.1.5 主要仪器22-23
• 2.2 实验方法23-30
• 2.2.1 分子操作23-26
• 2.2.2 类脂A的提取26-27
• 2.2.3 磷脂的提取27
• 2.2.4 薄层层析和质谱鉴定27-28
• 2.2.5 磷脂的高效液相色谱28
• 2.2.6 RT-PCR28-30
• 第三章 结果和讨论30-78
• 3.1 KT2442磷脂和类脂A组分和结构鉴定30-34
• 3.1.1 磷脂组分和结构鉴定30-31
• 3.1.2 类脂A结构鉴定31-34
• 3.2 pagL1和pagL2基因功能鉴定34-39
• 3.3 环境条件对pagL1、pagL2的调控探究39-51
• 3.3.1 不同温度对类脂A脱酰基化影响39-42
• 3.3.2 二甲苯对类脂A脱酰基化的影响42-45
• 3.3.3 不同锌离子浓度对类脂A脱酰基化的影响45-48
• 3.3.4 不同镁离子浓度对类脂A脱酰基化影响48-51
• 3.3.5 不同pH对类脂A脱酰基化影响51
• 3.4 二元调控系统对类脂A脱酰基化的影响51-71
• 3.4.1 LB环境下PhoP-Pho Q对类脂A脱酰基化的影响52-54
• 3.4.2 二甲苯存在环境下Pho P-Pho Q对类脂A脱酰基化的影响54-56
• 3.4.3 高浓度锌离子条件下Pho PQ对脱酰基化功能的影响56-58
• 3.4.4 高浓度镁离子条件下Pho P-Pho Q对类脂A脱酰基化的影响58-59
• 3.4.5 低浓度镁离子条件下Pho P-Pho Q对类脂A脱酰基化的影响59-61
• 3.4.6 LB条件下ColR-ColS调控系统对类脂A脱酰基化的影响61-62
• 3.4.7 二甲苯存在条件下ColR-ColS对类脂A脱酰基化的影响62-65
• 3.4.8 锌离子存在条件下ColR-ColS对类脂A脱酰基化的影响65-67
• 3.4.9 高镁离子条件下ColR-ColS对类脂A脱酰基化的影响67-68
• 3.4.10 低镁离子条件下ColR-ColS对类脂A脱酰基化的影响68-70
• 3.4.11 Pho P-Pho Q和ColR-ColS调控方式分析70-71
• 3.5 其他类脂A相关基因功能探究71-78
• 3.5.1 lpxO1、lpxO2基因功能鉴定71-73
• 3.5.2 lpxL2基因功能鉴定73-75
• 3.5.3 eptA基因功能初步探究75-76
• 3.5.4 其他类脂A相关基因存在的可能性探究功能初步探究76-78
• 主要结论与展望78-80
• 主要结论78-79
• 展望79-80
• 致谢80-81
• 参考文献81-86
• 附录86-88
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文88

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本文编号：1130265