灯盏花查尔酮异构酶基因的克

发布时间：2017-11-02 07:19

  本文关键词：灯盏花查尔酮异构酶基因的克隆、转化及MYB调控基因的克隆

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【摘要】：灯盏花,又名短亭飞蓬(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.),为菊科飞蓬属植物的全草,主要的有效药用成分为类黄酮化合物。类黄酮是植物体内产生的一类重要次生代谢物,其特殊的生理活性和多元性的生物功能使它成为当下植物学、遗传学、药理学、植物生理学、植物营养学等学科的研究重点、热点。黄酮类是由植物体内的类黄酮代谢途径及其衍生的各代谢通道所合成。参与该合成途径有关的结构基因及其调控元件,不仅在结构上具有较强的保守性,同时在功能上也具有保守性。因此,利用生物信息学手段,基于公共数据库中有关模式植物的研究数据,可快速、较为准确的获得某一植物中与类黄酮代谢途径的相关结构基因、调控元件的相关信息。在获得这些信息的基础上,通过基因克隆、转基因以及表现测定,就能较为准确的判定及研究某一种植物中,参与类黄酮生物合成途径的关键基因的结构、功能及其与环境的互作机制。灯盏花查尔酮异构酶(CHI)是黄酮类化合物代谢途径中的一个关键酶,而MYB转录因子是参与合成代谢途径调控的重要因子。本研究利用转录组数据分析筛选出一条CHI unigene和一条MYB unigene,利用RACE技术从灯盏花中克隆获得CHI和MYB全长基因。在此基础上,利用生物信息学对其结构及功能进行了分析,并以PBI121-EGFP为基础载体,构建了CHI和MYB基因与GFP形成融合蛋白的表达载体。通过根癌农杆菌GV3101介导的植物转基因方法将EGFP-CHI重组基因整合到灯盏花基因组中,同时建立灯盏花的遗传转化体系的基本方法。本研究对于从整体水平认识灯盏花类黄酮合成关键基因的结构与功能,以及通过分子手段调控灯盏花黄酮类物质生物合成具有深远意义。本研究获得的成果如下:1.CHI基因、MYB基因的克隆及生物信息学分析通过RACE末端扩增法克隆得到了灯盏花CHI全长基因717 bp,MYB全长基因780 bp,分别编码238个氨基酸和260个氨基酸。本研究对灯盏花CHI基因与MYB基因的同源性和进化发育进行分析,结果表明该灯盏花CHI基因功能与查尔酮异构酶活性和类黄酮生物合成密切相关。MYB蛋白N端保守结构域为[W]-x(20)-[W]-x(20)[W]-x(32)[W]-x(19)-[W],属于R2R3-MYB家族,其功能与类黄酮合成的结构基因活性和类黄酮生物合成途径调控有关。2.CHI基因和MYB基因的重组载体的构建及转化将CHI和MYB基因与PBI121-EGFP载体连接构建重组载体。通过电击法将两个基因的重组载体分别转化到农杆菌GV3101细胞中。3.农杆菌介导的灯盏花遗传转化体系构建利用不同浓度卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)处理灯盏花叶片组织,研究灯盏花叶片对两种抗生素的敏感性。经研究选择Kan 5 mg/L和Cef 200mg/L为筛选标记浓度和农杆菌抑制剂浓度。利用根癌农杆菌GV3101介导的叶盘转化法将EGFP-CHI融合重组基因整合到灯盏花中,经过Kan 5 mg/L+Cef 200mg/L的抗性培养基筛选培养,得到转化后的冠瘿瘤状组织。
【关键词】：灯盏花 类黄酮生物合成 CHI MYB 植物遗传转化
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第1章 引言11-20
• 1.1 灯盏花简介11
• 1.2 类黄酮化合物的研究11-12
• 1.2.1 类黄酮的概念11
• 1.2.2 类黄酮的功能11-12
• 1.3 灯盏花中类黄酮合成的可能途径12-13
• 1.4 类黄酮合成路径中的关键基因13-17
• 1.4.1 查尔酮异构酶（CHI）基因14
• 1.4.2 MYB类转录调控基因14-17
• 1.4.2.1 转录调控的概念14-15
• 1.4.2.2 MYB转录因子的结构及其调控机制15
• 1.4.2.3 转录因子R2R3-MYB15-17
• 1.5 植物遗传转化的研究17-19
• 1.5.1 农杆菌介导的植物遗传转化法17
• 1.5.2 影响遗传转化的因素17-19
• 1.6 研究意义及内容19-20
• 第2章 灯盏花CHI和MYB基因的转录组学研究20-24
• 2.1 实验方法20-21
• 2.1.1 CHI unigene的筛选20-21
• 2.1.2 MYB unigene的筛选21
• 2.2 结果21-22
• 2.2.1 CHI unigene的确定21
• 2.2.2 MYB unigene的确定21-22
• 2.3 小结22-23
• 附图23-24
• 第3章 灯盏花CHI和MYB基因的克隆24-53
• 3.1 实验材料24-25
• 3.1.1 植物材料24
• 3.1.2 质粒和菌株24
• 3.1.3 试剂和仪器24-25
• 3.2 实验方法25-35
• 3.2.1 灯盏花叶片总RNA提取25-27
• 3.2.2 CHI和MYB基因的克隆27-33
• 3.2.2.1 CHI和MYB unigene的验证27
• 3.2.2.2 CHI和MYB基因 5'末端克隆27-30
• 3.2.2.3 CHI和MYB基因 3'末端克隆30-31
• 3.2.2.4 CHI和MYB基因的全长拼接31-32
• 3.2.2.5 pMD18-T载体构建及转化32-33
• 3.2.2.6 重组质粒的筛选与鉴定33
• 3.2.3 生物信息学分析33-35
• 3.3 结果35-51
• 3.3.1 灯盏花总RNA提取35
• 3.3.2 CHI及MYB unigene的验证35
• 3.3.3 CHI及MYB的克隆及载体构建35-36
• 3.3.4 灯盏花CHI及MYB的核酸序列信息分析36-41
• 3.3.5 灯盏花CHI蛋白序列信息分析41-45
• 3.3.6 灯盏花MYB蛋白序列信息分析45-51
• 3.3.6.1 灯盏花MYB与拟南芥At MYB比对分析45
• 3.3.6.2 灯盏花MYB蛋白的结构特征45
• 3.3.6.3 灯盏花MYB蛋白的功能预测45-51
• 3.4 小结51-53
• 第4章 植物表达载体的构建及灯盏花的遗传转化53-72
• 4.1 实验材料53-55
• 4.1.1 植物材料53
• 4.1.2 质粒和菌株53
• 4.1.3 实验所用主要试剂53-55
• 4.2 实验方法55-64
• 4.2.1 重组载体的构建55-61
• 4.2.1.1 大肠杆菌质粒DNA的提取58-59
• 4.2.1.2 目的片段的扩增59-60
• 4.2.1.3 酶切反应及连接转化60-61
• 4.2.2 重组载体转化农杆菌GV310161-62
• 4.2.2.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备61
• 4.2.2.2 重组载体的电击转化61-62
• 4.2.2.3 重组载体的鉴定62
• 4.2.3 根癌农杆菌介导的灯盏花遗传转化62-64
• 4.2.3.1 灯盏花无菌苗的获得62
• 4.2.3.2 灯盏花对Kan的敏感性62-63
• 4.2.3.3 灯盏花对Cef的敏感性63
• 4.2.3.4 农杆菌GV3101的培养63-64
• 4.2.3.5 灯盏花叶盘浸染及共培养64
• 4.2.3.6 筛选培养64
• 4.3 结果及分析64-71
• 4.3.1 重组载体的构建及电击转化64-67
• 4.3.2 灯盏花的遗传转化67-71
• 4.3.2.1 灯盏花对Kan的敏感性67
• 4.3.2.2 灯盏花对Cef的敏感性67-70
• 4.3.2.3 筛选培养70-71
• 4.4 小结71-72
• 第5章 讨论72-75
• 5.1 通过转录组数据获取目的基因的方法讨论72-73
• 5.2 关于灯盏花MYB转录因子的功能讨论73-74
• 5.3 灯盏花遗传转化体系建立过程中遇到的问题74-75
• 参考文献75-83
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果83-84
• 致谢84

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6 夏玉叶;钟雁;章兰芳;闵e，

本文编号：1130534