婆罗双树样基因4慢病毒干扰载体构建及对MGC80-3转移潜能的影响

发布时间：2017-11-03 15:35

  本文关键词：婆罗双树样基因4慢病毒干扰载体构建及对MGC80-3转移潜能的影响

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【摘要】：目的人婆罗双树样基因4(spalt-like transcription factor 4,SALL4)是近年来新发现的癌基因,具有促进肿瘤生长和转移的作用。本研究旨在构建可诱导shRNA基因干扰SALL4慢病毒载体并转染胃癌细胞建立稳定细胞株,探讨SALL4基因沉默对胃癌细胞转移潜能的影响。方法合成特异性靶向人SALL4基因的shRNA序列,连接入TetpLKO-puro慢病毒载体;脂质体法介导重组慢病毒质粒系统转染293T细胞,包装产生慢病毒;收集病毒上清,转染人胃癌细胞株MGC80-3,嘌呤霉素筛选获得阳性克隆,采用四环素(tetracycline,Tet)诱导shRNA表达。同时设立shRNA对照组。荧光定量RT-PCR检测SALL4mRNA水平;蛋白质印迹检测SALL4蛋白水平;Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹分别检测干性指标Oct4和上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)指标E-cadherin、Slug和Twist基因及蛋白表达水平。结果 PCR结果表明,SALL4shRNA序列已成功连入Tet-pLKO-puro慢病毒载体。荧光定量RT-PCR结果表明,对照组Tet-PLKO-shCtrl细胞在Tet诱导前后,SALL4mRNA水平分别为1.015±0.150和0.932±0.127,P=0.580;实验组Tet-PLKO-shSALL4细胞在Tet诱导前后,SALL4mRNA水平分别为1.000±0.028和0.443±0.017,P0.001。蛋白质印迹结果显示,SALL4蛋白与mRNA变化一致。Transwell迁移实验显示,对照组Tet-PLKO-shCtrl细胞Tet诱导前后,迁移细胞数分别为(327±66)和(330±50)个,P=0.856;Tet-PLKO-shSALL4细胞Tet诱导前后,迁移细胞数分别为(335±44)和(100±23)个,P0.001。荧光定量RT-PCR检测结果表明,Tet-PLKO-shSALL4细胞Tet诱导后,干性指标Oct4及EMT指标Slug和Twist mRNA水平分别为0.140±0.003、0.532±0.047和0.652±0.033,P值分别为0.001、0.008和0.035;E-cadherin mRNA水平增加至8.994±0.689,P0.001。对照组经Tet诱导,Oct4、Slug、Twist和E-cadherin基因表达水平分别为1.180±0.010、0.931±0.016、0.978±0.036和1.330±0.371,P值分别为0.063、0.086、0.646和0.300。蛋白质印迹与荧光定量RT-PCR结果一致。结论成功构建可诱导shRNA基因干扰SALL4慢病毒载体,并建立稳定转染胃癌细胞株。Tet诱导SALL4shRNA表达可显著下调SALL4基因表达水平和抑制胃癌细胞MGC80-3的迁移能力。
【作者单位】： 江苏省检验医学重点实验室江苏大学医学院;
【基金】：国家自然科学青年基金(81201660) 江苏省自然科学基金(BK20141303) 江苏省“青蓝工程”项目 江苏省检验医学重点实验室开放基金(JSKLM-2014-006) 镇江市社会发展项目(SH2015034) 江苏大学高级专业人才科研启动基金(13JDG086);江苏大学大学生科研立项(14A379)
【分类号】：R735.2
【正文快照】： 中华肿瘤防治杂志,2016,23(16):1060-1066Chin J Cancer Prev Treat,2016,23(16):1060-1066胃癌是常见消化道恶性肿瘤之一,我国是胃癌高发国家,胃癌发病率和死亡率位居所有恶性肿瘤的第3位[1]。胃癌发病机制复杂,早期难发现,晚期难治疗,近年发病具有年轻化趋势。因此,阐明胃癌

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