猪圆环病毒2型ORF6基因功能的初步研究

发布时间：2017-11-04 18:36

  本文关键词：猪圆环病毒2型ORF6基因功能的初步研究

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【摘要】：猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪可以引发断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征及猪坏死性和增生性肺炎等多种疾病。PCV2广泛流行于全世界范围内,给养猪业造成了巨大的经济损失,然而其致病机制尚不清楚。通过生物信息学分析预测,PCV2含有11个ORFs(ORF1-11)。目前,PCV2被验证鉴定的蛋白有五个,包括ORF1-5。本研究鉴定了一个新的蛋白,ORF6。ORF6基因全长90bp,位于PCV2的负链DNA1611-1522bp,编码30aa,预测分子量为2.8k D。本研究主要鉴定了PCV2 ORF6蛋白,并对其生物学功能进行了初步研究,具体的研究内容有:1.PCV2 ORF6原核表达及多克隆抗体的制备通过设计引物连入一个柔性多肽(Gly4Ser)2,利用PCR,将2个ORF6基因片段串联在一起,再插入p GEX-KG原核表达载体中,构建了原核表达质粒p GEX-2ORF6。对其进行原核诱导表达,获得融合表达蛋白GST-2ORF6,且该蛋白是以可溶形式存在的。进一步纯化蛋白,免疫2只兔子,获得兔高免血清。高免血清浓度分别为1.59mg/m L和2.38mg/m L,效价分别为1:25×1000和1:27×1000,抗体1:1000稀释可检测到500pg抗原。2.PCV2 ORF6的转录表达验证ORF6基因完全包含于ORF2中,为验证ORF6 m RNA的转录,本研究利用荧光定量PCR检测了PCV2感染PK-15细胞后的ORF2+6与ORF2的m RNA差异。结果病毒感染细胞后不同时间ORF2+6 m RNA均明显多于ORF2 m RNA,不同时间ORF2+6约是ORF2的2.1~3倍。验证了PCV2 ORF6 m RNA的转录。进一步将PCV2野毒接种PK-15细胞,利用制备的ORF6多抗进行间接免疫荧光检测,结果观察到PCV2感染细胞后有特异性绿色荧光,表明PCV2感染细胞内存在ORF6蛋白。验证了ORF6蛋白的表达。通过ORF6基因的转录与蛋白表达检测,证实了PCV2 ORF6编码蛋白。3.PCV2 ORF6的细胞定位及真核表达为研究ORF6蛋白的亚细胞定位,我们将PCV2野毒接种PK-15细胞,利用ORF6多抗进行IFA检测PCV2 ORF6在细胞内的分布情况,结果发现ORF6主要分布于细胞浆内。本研究构建了ORF6基因的串联双拷贝的真核表达质粒p CAGGS-2ORF6。将表达质粒转染HEK-293T,通过Western blot检测验证了ORF6在体外获得表达。4.感染性克隆的构建及体外病毒拯救以PCV2全基因组为模板设计引物,扩增含有特定酶切位点HindⅢ、SacⅡ的PCV2全长基因片段和含2个SacⅡ酶切位点的PCV2全长基因片段,连入p Bluescript SK载体,构建了PCV2双拷贝感染性克隆(野生型PSK-2PCV2)。同时,为了构建ORF6表达缺失的突变株,通过PCR,将ORF6的起始密码子ATG进行突变为ACG,使其表达沉默,同时不影响ORF2的蛋白编码序列。再利用与构建野生型PSK-2PCV2同样方法构建ORF6表达缺失双拷贝感染性克隆(突变型PSK-2PCV2)。将野生型PSK-2PCV2和突变型PSK-2PCV2感染性克隆转染PK-15细胞后,盲传3代。通过荧光定量PCR检测、ORF2 m RNA转录检测及IFA试验证实病毒拯救成功,能在体外增殖传代。利用荧光定量PCR对不同病毒的体外增殖情况进行检测,结果发现ORF6缺失后病毒仍能进行复制,进一步利用一步法增殖曲线发现ORF6缺失后病毒的增殖滴度明显下降。证实ORF6不是病毒复制所必需的基因,但ORF6影响病毒在体外的增殖滴度。5.PCV2 ORF6的生物学功能本研究利用凋亡检测试剂盒对单独表达ORF6及野生型和突变型病毒感染细胞后的caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性进行检测,结果显示,单独表达PCV2ORF6不能激活caspase-3、caspase-8、caspase-9。但突变毒株较野生毒株的caspase-3蛋白活性显著升高,caspase-8蛋白活性有所下降,caspase-9的蛋白活性无显著差异。ORF6在PCV2诱导凋亡中的作用还需进一步研究。将ORF6真核表达质粒转染PK-15细胞,利用荧光定量PCR检测IFN-β、TNF-α、RANTES、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13等细胞因子的表达量,结果发现单独表达ORF6能促使IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13细胞因子表达量显著升高。同时将野生重组型(w-2PCV2)、突变型(m-2PCV2)病毒分别接种PK-15细胞,荧光定量PCR检测上述细胞因子表达量,发现ORF6缺失导致病毒感染细胞后IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-13等细胞因子表达量显著下降。综合ORF6表达与病毒感染分析,证实ORF6蛋白能激活IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13细胞因子的表达。6.PCV2 ORF6对IL-10的影响IL-10参与病毒感染宿主诱导的免疫调节及免疫抑制反应,为探究ORF6引起IL-10表达量上升的信号通路,利用不同的信号通路抑制剂对其进行研究,发现蛋白激酶PKC抑制剂GF-109203X能显著下调ORF6激活IL-10的表达量。进一步利用不同浓度的GF-109203X抑制剂处理细胞,发现ORF6诱导IL-10的表达量与抑制剂浓度呈反比关系,即抑制剂浓度越高,其ORF6诱导IL-10的表达量越低。表明ORF6诱导IL-10表达是通过蛋白激酶C通路激活的。总之,本研究新鉴定了PCV2 ORF6蛋白,其表达定位于细胞浆内。ORF6不是病毒复制所必需的基因,但ORF6影响病毒在体外的增殖滴度。ORF6蛋白能激活IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12p40、IL-13细胞因子的表达,且通过蛋白激酶C通路激活IL-10表达。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1140675