棉花（Gossypium hirsutum）PYL基因的分离与鉴定

发布时间：2017-11-07 00:31

  本文关键词：棉花（Gossypium hirsutum）PYL基因的分离与鉴定

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【摘要】：棉花是非常重要的经济作物之一,在世界各地都有种植。棉花的主产品棉纤维是一种天然的纺织纤维,是纺织工业的重要原材料。在棉花生长发育中,常常出现一些不利的环境条件,例如干旱、水涝、低温、高盐等。这些不利的环境因素严重影响棉花正常生长,造成减产减收。如何提高棉花品种对上述不良环境的抗性是目前各国研究人员关注的问题,其中通过转基因技术向棉花基因组中引入新的抗逆基因是一种非常具有前景的策略。脱落酸(ABA)是一种植物激素,ABA核心信号通路在植物对非生物胁迫的应答中发挥关键作用。ABA受体PYL蛋白、负调控因子A类PP2C蛋白、正调控因子SnRK2s蛋白和下游的效应因子共同组成了一条完整的ABA核心信号通路。对棉花中编码这些蛋白的基因进行克隆鉴定和功能研究,有助于更好地理解棉花ABA信号通路,从而为棉花抗逆基因的筛选鉴定提供线索。本文在棉花基因组中分离了27个编码棉花ABA的受体PYL蛋白的基因,命名为GhPYLl-27,对这些PYL基因及其编码蛋白进行了序列与进化分析、组织表达和胁迫诱导表达分析,以及它们与PP2C蛋白的相互作用及转基因拟南芥表型分析等,主要结果如下：1、棉花PYL基因的分离鉴定和序列结构及进化分析依据与拟南芥PYL蛋白的序列相似性,我们从棉花基因组中分离了27个GhPYL基因,这些基因的ORF长约600bp,编码的氨基酸数目在200个左右,在一些二级结构上非常保守。依据与拟南芥PYL蛋白的同源性可将其分为三个亚组。2、棉花PYL基因的组织表达和胁迫诱导表达分析分析了其中9个GhPYL基因在棉花组织中的表达谱,结果显示它们具有不同的组织表达模式。GhPYL1在根、下胚轴、子叶中的表达量相对较高,GhPYL8、 GhPYL12在根中强烈表达,而GhPYL26在各组织中表达量相差不大。利用定量RT-PCR技术对5个棉花PYL基因(GhPYLl、GhPYL8、GhPYLl0、GhPYL12和GhPYL26)的表达进行了定量分析,研究它们是否在干旱胁迫下诱导表达,结果显示在晋棉13号受到干旱胁迫后,这5个GhPYL基因均出现了下调表达。3、棉花PYL蛋白与PP2C蛋白在酵母中的相互作用将GhPYL基因构建到AD载体,GhPP2C基因构建到BD载体,转化酵母进行酵母双杂交实验,结果表明GhPYL8、GhPYL10、GhPYL12、GhPY22、GhPYL25和GhPYL26蛋白能够与棉花PP2C蛋白在酵母中发生相互作用,并且这种相互作用具有选择性。4、GhPYL1蛋白的亚细胞定位分析构建GFPrGhPYL1融合蛋白表达载体,通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,获得转基因植株。在共聚焦显微镜下观察转基因拟南芥幼苗根部细胞,发现GFP应该主要分布在细胞质与细胞核中,这表明GhPYLl蛋白定位于细胞质和细胞核。5、过量表达GhPYL转基因拟南芥对ABA的敏感性分析构建GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的过量表达载体,通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,获得转基因株系。统计野生型和转基因拟南芥在含ABA的MS培养基上的萌发率和绿苗率发现,3个GhPYL基因的转基因拟南芥相比野生型均萌发更慢,幼苗生长受到ABA更严重的抑制,说明过量表达GhPYLs增加了拟南芥在种子萌发和幼苗生长时期对ABA的敏感性。6、过量表达GhPYL转基因拟南芥对NaCl的敏感性分析统计野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的转基因拟南芥在含NaCl的MS培养基上的萌发率和绿苗率发现,过量表达GhPYL10和GhPYL12转基因拟南芥萌发率和绿苗率比野生型更低,而过量表达GhPYL26转基因拟南芥萌发率低于野生型。7、过量表达GhPYL转基因拟南芥对甘露醇的敏感性分析统计野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的转基因拟南芥在含甘露醇的MS培养基上的萌发率和绿苗率,结果显示野生型和转基因拟南芥的的萌发率和绿苗率没有显著差异。8、过量表达GhPYL转基因拟南芥的根长分析统计野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26转基因拟南芥在MS培养基上生长10天后的主根长度,发现过量表达GhPY12和GhPYL26转基因拟南芥主根长度比野生型更长,而过量表达GhPYL10转基因拟南芥主根长度与野生型无显著差异,说明过量表达GhPYL12和GhPYL26能促进拟南芥幼苗时期主根的生长发育。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S562

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本文编号：1150067