《中国科学院研究生院（海洋研究所）》2014年博士论文

发布时间：2016-09-18 13:20

  本文关键词：斑马鱼抗寒模型的构建及鱼类相关基因功能探讨，由笔耕文化传播整理发布。

《中国科学院研究生院（海洋研究所）》 2014年

斑马鱼抗寒模型的构建及鱼类相关基因功能探讨

王倩  

【摘要】：许多鱼类都具有非常重要的经济价值，并是我国主要的水产养殖品种。目前环境变化加剧，气温波动大并时常出现严寒气候，带来鱼类越冬死亡率高、越冬成本加大等问题，严重制约了鱼类养殖业的健康发展。因此，建立鱼类抗寒机理研究模型，研究阐明鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理具有重要的应用意义。本研究对抗寒相关候选基因进行分析，采用肌肉Ⅲ型肌酸激酶（m3ck）基因构建转基因斑马鱼，探讨了低温下可能发挥作用的分子调控网络；对谷胱甘肽巯基转移酶M（GSTM）基因进行了DNA序列多态性分析，筛选出与鱼类低温耐受性相关的SNP分子标记；并对牙鲆IV型抗冻蛋白（AFP-IV）基因进行体外蛋白重组表达，以期对其抗冻活性进行体外分析。主要研究结果如下： 1、构建转基因质粒并通过显微注射方法获得了2个组织特异性转m3ck基因斑马鱼系，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼为骨骼肌特异性启动子smyd1驱动m3ck表达，Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼为心肌特异性启动子cmlc驱动m3ck表达。将转基因鱼培养至F2代，其阳性率分别为34.90%（22/63）和58.75%（47/80）。低温处理后行为学观察结果显示，Tg (smyd1: m3ck)转基因鱼游动能力较好、身体偶有摆动、对外界刺激有应激性的鱼数目百分比均比野生斑马鱼显著增加（P 0.05），完全静止、身体出现翻转及死亡的鱼数目百分比均比野生斑马鱼显著减少（P0.05）；Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼仅表现为身体出现翻转的鱼数目百分比比野生斑马鱼显著减少（P0.05）。生理指标检测结果显示，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼常温及低温下肌肉组织能量（ATP浓度）均比野生斑马鱼显著增加（P0.05）；Tg (cmlc: m3ck)转基因鱼常温及低温下心脏组织能量与野生斑马鱼无显著差异。 2、以Tg (smyd1: m3ck)转基因鱼为模型，借助表达谱芯片分析常温及低温下转基因鱼与野生鱼基因表达变化。Microarray检测到1249个差异转录本，GO分析及KEGG pathway分析发现转基因斑马鱼的低温诱导基因主要涉及类固醇生物合成和磷酸肌醇代谢途径。这些途径主要参与环境适应、信号转导和细胞膜构建等生物过程。野生型斑马鱼的低温诱导基因涉及MAPK信号通路、NOD受体信号通路、Toll样受体信号通路、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换等。此外，转基因鱼的低温抑制途径主要包括PPAR信号通路、细胞因子受体相互作用等途径，而野生斑马鱼包括原发性胆汁酸的生物合成、丙酮酸代谢、醚脂代谢和柠檬酸循环（TCA循环）等与能量代谢密切的生物过程。 3、以Tg (cmlc: m3ck)转基因鱼为模型分析能量对心脏的影响。F2代野生斑马鱼幼鱼与转基因鱼幼鱼（48hpf）分别进行低温（13°C）及常温（28°C）处理，心脏搏动频率统计结果显示，常温下野生斑马鱼心率为152.88±4.01次/分，低温处理后显著下降为41.20±4.13次/分（P 0.01）；常温下野生斑马鱼心率为187.50±7.84次/分，低温处理后为87.82±9.71次/分，均比野生斑马鱼显著增加（P 0.05）。且低温下转基因斑马鱼心率可达野生斑马鱼的57.44%。对早期心脏发育模式进行分析，发现转基因斑马鱼心脏发育时期比野生斑马鱼有明显提前。 4、运用PCR-SSCP技术对斑马鱼实验群体中低温耐受及低温敏感组进行GSTM基因多态性分析，在第1内含子中获得1个与低温耐受性状相关的多态位点，，检测到DD、DE和EE3种基因型，共D、E2个等位基因，该群体的观测杂合度和期望杂合度分别为0.408和0.477，多态信息含量为0.362，在该位点符合Hardy-Weinberg平衡。连锁分析结果显示，这3种基因型与低温耐受性状显著相关（χ2=8.498，P 0.05）：DD基因型在耐低温群体中占优势（50.00%），并表现为对受低温胁迫斑马鱼的保护性因素（OR=0.520,95%CI=0.255-1.061），而DE基因型在不耐低温群体中占优势（51.31%），表现为低温胁迫下斑马鱼的危险因素（OR=3.012，95%CI=1.413-6.419）。研究结果为鱼类耐低温标记的筛选提供依据。 5、在牙鲆cDNA文库中筛得IV型抗冻蛋白（AFP-IV）同源基因AFP-IV-1、AFP-IV-2。AFP-IV-1基因cDNA全长为652bp，其开放阅读框为375bp，编码124个氨基酸残基；AFP-IV-2基因cDNA全长为781bp，其开放阅读框为465bp，编码154个氨基酸残基。应用原核表达系统进行体外重组表达，AFP-IV-1重组蛋白得到成功表达，融合蛋白的分子量理论值为19.36kDa KDa，主要以可溶形式存在，少量以包涵体形式出现。当诱导4h、IPTG浓度为0.6mM时，重组蛋白表达量最大。对目的蛋白进行纯化，以期对其抗冻活性进行体外分析。 综合上述结果，本研究对斑马鱼、牙鲆抗寒相关候选基因进行分析，揭示大量抗寒相关候选基因及低温下可能发挥作用的调控网络；筛选出1个与斑马鱼低温耐受性相关的SNP分子标记；并纯化出可能具有抗冻活性的重组牙鲆抗冻蛋白。研究结果不仅有助于解析鱼类耐抗寒基因调控网络及其作用机理，也可为鱼类耐低温标记的筛选及其在海水经济鱼类抗寒育种中的应用提供依据和参考。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S917.4
【目录】：

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本文编号：117379