阿霉素合成途径关键酶基因的异源表达

发布时间：2017-11-12 13:13

  本文关键词：阿霉素合成途径关键酶基因的异源表达

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【摘要】：阿霉素具有强烈的生物化学效应,是临床上的一种重要抗肿瘤药物。阿霉素可由Streptomyces peucetius ATCC 27952天然微量合成；传统的化学法大规模合成阿霉素因其成本高、污染环境等缺点而制约了该药的生产。阿霉素高产菌株的筛选一直是该药生物合成法的研究热点。在这些研究中,基因工程则表现出良好前景,特别是近年来合成生物学的快速发展。本研究则指向阿霉素关键酶基因的异源表达,以期实现阿霉素代谢通路的异源化构建,进一步实现阿霉素的异源菌株的从头合成。具体内容包括：1、针对阿霉素生物途径长、涉及关键酶基因繁多,以商业化的pET-28a载体为基础,将该载体的T7启动子前的Xba Ⅰ酶切位点失活,并在其后面加一个Xba Ⅰ酶切位点；在T7终止子后加一个SpeⅠ酶切位点。构建出多基因串联共表达载体,并命名为pBD,方便后续多基因的共表达；2、利用基因组提取试剂盒提取了S. peucetius基因组,用PCR克隆技术克隆并构建阿霉素合成关键酶基因的T载体,然后构建表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,实现异源表达。克隆了阿霉素天然合成途径中负责成链、成环以及成环后糖基化及其修饰基因共16个,依次为dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsE、dpsF、dpsG、 dnrC、dnrD、dnrE、dnrF、doxA、dnrK、dnrP,表达了成链过程中关键酶基因依次为dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsF、 dpsG、dnrG/dpsY,其中dpsCA、dpsE、dpsF、dpsY、dnrG正常表达。3、考虑到外源基因过表达往往降低工程菌的生物量,而生物量的积累往往会促进产量的提高：而大肠杆菌与克雷伯氏菌(Klebsiella. AA 405)遗传背景非常相似,研究了Klebsiella. AA 405自身生长基因的过表达对甘油代谢途径中1,3-丙二醇、2,3-丁二醇产量的影响。结果发现,与携带空质粒重组菌相比,过表达编码核糖ABC转运酶的rbsC基因工程菌可使其生物量和甘油转化率分别提高16.08%和24.69%,而1,3-丙二醇和2,3-丁二醇产量则分别提高了39.59%和19.79%；过表达编码tRNA核苷酸转移酶基因cca则可使其生物量和甘油转化率分别提高7.17%和19.16%,而1,3-丙二醇和2,3-丁二醇产量则分别提高了36.24%和13.39%。结果表明通过刺激细菌的生长可促进目标产物的积累。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ460.1;Q78

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本文编号：1176040