黄色花形成机制及基因工程研究进展

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第 45 卷 第 2 期 2009年 2 月

林
SCIENTIA

业

科
SILVAE

学
SINICAE

黄色花形成机制及基因工程研究进展
周　 　 　 　 琳 王 雁 彭镇华
( 中国林业科学研究院林业研究所 国家林

业局林木培育重点实验室 　 北京 100091)

摘　 :　 要 通过对黄色花的花色素组成及其主要花色素生物合成途径中相关酶和基因的介绍 ,综述黄色花形成的 生物化学及分子生物学机制研究进展 ,并分析利用基因工程技术 ,通过抑制花色苷合成途径中关键酶的基因表达 讨黄色花卉基因工程研究中存在的主要问题和应用前景 。 关键词 : 　 黄色花 ; 形成机制 ; 基因工程 中图分类号 :S718146 　　　 文献标识码 :A 　　　 文章编号 :1001 - 7488 (2009) 02 - 0111 - 09

或导入外源黄色花形成相关基因 ,获得黄色花卉新品种的可行性 , 以期为开展黄色花分子育种提供参考 。同时探

Advances in Study on Formation Mechanism and Genetic Engineering of Yellow Flowers
Zhou Lin 　 Wang Yan 　 Peng Zhenhua
( Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration 　Research Institute of Forestry , CA F 　Beijing 100091)

Abstract : 　 This paper introduced flower pigments composition , and related enzymes and genes involved in the main pigments biosynthetic pathway in yellow flowers , and reviewed the advances in study on the biochemical and molecular biological mechanism of yellow flowers’ formation are summarized ,and analyzed the feasibility of using genetic engineering to breed yellow flower plants. The main pathways include inhibiting the gene expression of the key enzymes of anthocyanin biosynthesis or introducing some exotic related genes about yellow flower generation. This review intended to offer the reference on yellow flower molecular breeding. Finally , main problems and perspectives about the research of yellow flower genetic engineering were discussed. Key words : 　 yellow flower ; formation mechanism ; genetic engineering

　　 花色的优劣直接关系到观赏植物的观赏价值和

利用基因工程技术能够扩大植物基因库 、 定向修饰 等特点开展花色分子育种已成为花卉基因工程研究 的重点 ( Tanaka et al . ,1998 ; 2005) 。其中 ,蓝色花形 成机制和转基因育种研究得最为深入 , 并取得了一 系 列 令 人 瞩 目 的 成 果 ( Brugliera et al . , 2000 ;
Katsumoto et al . ,2007) 。

商业价值 ,是观赏植物最重要的质量指标之一 。因

此 ,培育具有新型花色的花卉新品种一直是观赏植 物育种领域的研究热点 (Mol et al . ,1999) 。长期以 来 ,传统杂交育种和定向选择育种在花色改良中做 出了重要贡献 ,但传统育种难以打破植物生殖隔离 ,

造成一些重要的观赏植物仍然欠缺某些花色品系 , 如天竺葵 ( Pelargonium graveolens ) 、 仙客来 ( Cyclamen
persicum ) 、 翠菊 ( Callistephus chinensis ) 等缺乏纯黄色 ,

色彩鲜艳的黄色花以其能够给人以活力 、 明朗

和高贵的感觉而受到广泛喜爱 。针对一些重要观赏 植物欠缺黄色品系的问题 , 近年来育种工作者对黄 色花的形成机制也进行了不断探索 , 为实现黄色花 分子育种提供了有益的借鉴 。然而 , 尽管有关花色 形成机制及其基因工程改良的综述有很多 ( 于晓南 等 ,2002 ; Tanaka et al . ,2005 ; 2008a) ,但目前针对黄 色花研究进展的综述还未见发表 。本文根据前人的 研究 ,就黄色花形成的化学基础 、 黄色花色素的生物 合成途径以及相应的分子育种思路进行了阐述 , 并 探讨了存在的问题及发展前景 , 以期为今后黄色花

月季 ( Rosa chinensis ) 、 香石竹 ( Dianthus caryophyllus ) 、 菊花 ( Dendranthema morifolium ) 等缺少蓝色和紫色 , 球根鸢尾 ( Iris xiphium ) 、 紫罗兰 ( Matthiola incana ) 等 缺乏猩红色或砖红色 ( 彭镇华等 ,2001) 。

近年来 ,随着花色形成机制研究的不断深入 ,参

与花色形成的色素生物合成途径中很多相关酶和基 因 相 继 被 分 离 和 克 隆 ( Springob et al . , 2003 ;
Grotewold ,2006 ; Tanaka et al . ,2008b) 。在此基础上 ,
收稿日期 :2008 - 02 - 27 。 3 王雁为通讯作者 。

基金项目 “十一五” : 国家高技术研究发展计划 (863 计划) 项目 (2006AA100109) ; 国家林业局 948” “ 项目 (2006 - 4 - C07) 资助 。

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Vol145 ,No12 Feb. ,2 0 0 9

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基因工程改良提供理论依据 。

1　 黄色花的花色素组成
决定 花 色 的 化 学 物 质 主 要 包 括 类 黄 酮 (flavonoids) 、 胡 萝 卜 素 ( carotenoids ) 和 甜 菜 色 素 类 ( betalains) 三类 。类黄酮是大多数花色形成的决定 性色素群 ( 黄金霞等 ,2006) ,存在于花瓣表皮细胞液 泡中 ,除花色素苷 ( anthocyanin) 属红色系 , 控制花的 粉红 、 、 、 红 蓝 紫和紫红色外 , 其他均属黄色系 , 其中 查耳 酮 ( chalcone ) 和 噢 　 ( aurone ) 为 深 黄 色 , 黄 酮 (flavone) 、 黄酮醇 (flavonol ) 、 黄烷酮 (flavanone ) 等为 淡黄 色 或 接 近 无 色 ; 类 胡 萝 卜 素 是 胡 萝 卜 素 (carotene) 和叶黄素 ( xanthophylls) 的统称 , 存在于质 体内 ,广泛分布在植物的花 、 、 叶 根和果皮等部位 ,使 其呈现黄色 、 橙色或红色 ; 甜菜色素是由酪氨酸衍 生而来的含氮化合物 , 它是三大色素群中含量最少 的一类 ,由 ( 深) 红色的甜菜红素 ( betacyanins) 和黄色 的甜菜黄素 ( betaxanthins) 组成 ,参与花瓣黄色 、 橙色 及红色的形成 ,仅存在于除粟米草科 (Molluginaceae) 和石竹科 ( Dianthus) 以外的石竹目 ( Caryophyllales) 的 一些 植 物 中 , 如 苋 科 ( Amaranthaceae ) 、 茉 莉 科 紫 (Nyctaginaceae) 、 商陆科 ( Phytolaccaceae ) 等 ( Strack et al . ,2003) 。 广义的黄色花根据其颜色深浅的不同 , 从接近 白色的浅黄到鲜艳的深黄可以分为多种花色 。其 中 ,肉眼难以辨别的几乎为白色的浅黄色花 ,如白蔷 薇花 ( Rosa spp . ) 、 白菊花等色素构成非常简单 , 只 含浅黄色或接近无色的类黄酮 ,如黄酮 、 黄酮醇等这 一类色素 ; 而肉眼能够感知的黄色花色素组成相对 比较复杂 ,主要与类黄酮和类胡萝卜素两大色素类 群有关 ,并根据植物种类的不同 ,有的只含类黄酮或 类胡萝卜素其中一类 ,如郁金香 ( Tulipa gesneriana ) 、 向日葵 ( Helianthus annuus ) 等 ; 有的则是类黄酮和类 胡萝卜素两者并存 , 如万寿菊 ( Tagetes erecta ) 、 酢酱 草 ( Oxalis corniculata ) 等等 ( 安田 齐 ,1989) 。另外 ,甜 菜 黄 素 在 鸡 冠 花 ( Celosia cristata ) 、 齿 苋 属 马 ( Portulaca ) 、 叶子花属 ( Bougainvillea ) 等植物的黄色 花形 成 中 起 了 主 要 作 用 ( Toyama et al . , 1992 ; Schliemann et al . ,2001 ; Kugler et al . ,2007) 。 从图 1 可以看出 , 呈黄色的类黄酮类化合物主 要有查耳酮和噢　两类 ( Tanaka et al . ,2005) 。其中 2′ 4′ 6′ 4 - 四 羟 基 查 耳 酮 ( 2′ 4′ 6′ 4 , , , , , , tetrapydroxychalcone ,THC) 容易在查耳酮异构酶或自 发异构的作用下形成无色的柚皮素 ( naringenin) , 因 此 ,它往往以 2′ 糖苷即异杞柳苷 ( isosalipurposide , -

ISP) 的形式稳定存在于液泡中 ,构成香石竹 、 金莲牡 丹 ( Paeonia potaninii var. trollioides ) 、 春 花 属 长 ( Catharanthus ) 等 植 物 黄 色 花 瓣 中 的 主 要 色 素 ( Harborne ,1966 ; Y oshida et al . ,2004) ; 另外 ,还发现

了其他几种分布较为集中的黄色查耳酮糖苷 , 如菊 科植物中的 6′ 脱氧查耳酮 ( 6′ deoxychalcones) 和 红 花 ( Carthamus tinctorius ) 中 的 红 花 黄 色 素 A ( safflomin A) 等 ( Tanaka et al . ,2005 ; 2008b) 。噢　 比查耳酮类色素呈现更鲜艳的黄色 , 但能够积累噢 的植物比较有限 ,主要分布在菊科 (Asteraceae) 、 玄 ( Scrophulariaceae) 和补血草属 ( Limonium ) 中 , 如 参科 金 鱼 草 ( Antirrhinum majus ) 和 波 斯 菊 ( Cosmos
bipinnatus ) 等 , 此外一些苔类植物中也有噢　合成

(Nakayama ,2002) 。

在含有类胡萝卜素的黄色花瓣中起主要作用的 是叶黄素类化合物 ( Tanaka et al . ,2008b) 。它是在 橙黄色的胡萝卜素分子中引入羟基 、 甲氧基及酯键 等转 化 成 的 一 类 含 氧 衍 生 物 , 常 见 的 有 隐 黄 质 ( cryptoxanthin ) 、 米 黄 质 ( zeaxanthin ) 、 黄 素 玉 叶 ( lutein ) 、堇 菜 黄 质 ( violaxanthin ) 和 新 黄 质 ( neoxanthin) 等 。通常 , 这类植物花瓣黄色的深浅与 其积 累 的 叶 黄 素 的 种 类 和 含 量 有 关 。宫 灯 百 合 ( Sandersonia aurantiaca ) 金黄色花瓣中主要为隐黄质 和玉米黄质 (Nielsen et al . ,2003) ; 金盏菊 ( Calendula
officinalis ) 中主要为毛茛黄素 (flavoxanthin) 和金黄质

( auroxanthin) (Bakóet al . ,2002) ; 旱金莲 ( Tropaeolum majus ) 中以叶黄素为主 , 另外还含有少量的堇菜黄

质和玉米黄质 (Niizu et al . ,2005) ; 万寿菊 (Moehs et al . ,2001) 和菊花 ( Kishimoto et al . ,2004) 黄色花瓣中 90 %以上的类胡萝卜素为叶黄素及其衍生物 , 且万 寿菊中叶黄素含量的不同是使其花色由白色到深橙 色变异的主要原因 ( Khachik et al . ,1999) 。

2　 黄色花花色素的生物合成及其基因
目前 ,除甜菜色素外 ,类黄酮和类胡萝卜素类色 素的生物合成途径都已基本明确 ( 图 1 、 2 , Tanaka 图 et al . , 2008b ) , 相关酶和基因的研究也非 常 深 入 ( Springob et al . ,2003 ; Tanaka et al . ,2008b ) 。本文 中主要针对上述在黄色花呈色中起重要作用的花色 素生物合成相关酶和基因进行阐述 。
211 　 查耳酮及其糖苷生物合成相关酶及基因 21111 　 查耳酮合酶 　 在类黄酮生物合成途径中 ( 图 1) ,查耳酮合酶 ( chalcone synthase ,CHS) 催化 1 个分

子的香豆酰 CoA 与 3 个分子的丙二酰 CoA 缩合形 成黄色的四羟基查耳酮 THC 。THC 为类黄酮类化合

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物提供了基本碳骨架 , 是一个重要的中间产物 。因 此 ,CHS 作为生物合成途径中的限速酶和关键酶 ,已 从多种植物中分离 、 纯化 ,相应的蛋白结构也已明确 ( Ferrer et al . ,1999) 。 CHS 是类黄酮合成途径中第一个被分离的基 因 ,最早是从欧芹 ( Petroselinum hortense ) 悬浮细胞中 得 到 的 ( Kreuzaler et al . , 1983 ) 。此 后 , 豆 科
(Leguminosae ) 、 字 花 科 ( Brassicaceae ) 、 花 科 十 旋 ( Convolvulaceae) 等多种植物的 CHS 相继被克隆 。序

max) 、 牵 牛 、 草 ( Nicotiana tabacum ) 等 植 物 的 矮 烟 CHI 也已被克隆 (Li et al . ,2006 ) 。研究表明 , 矮牵

牛基因组中存在 2 个 CHI , CHIA 在花组织和经紫外 线照射的幼苗中表达 , CHIB 仅在未成熟的花粉中表 达 ( van Tunen et al . ,1989) ; 过表达矮牵牛 CHIA 可 以提高番茄 ( Lycopersicon esculentum ) 果实中黄酮醇的 含量 ( Muir et al . , 2001 ) ; 导 入 反 义 水 母 雪 莲
( Saussurea medusa ) CHI 可抑制烟草中类黄酮的合成 (Li et al . ,2006) 。目前 , CHI 表达分析和调控机制

列同源性分析发现 , CHS 编码区保守性很强 , 不同 科植物间核苷酸水平上的同源性超过 60 % , 氨基酸 水平上的同源性达 80 % , 可以用于研究基因进化 (王金玲等 , 2000 ) 。 Yang 等 ( 2003 ) 通 过 对 山 茶 属 ( Camellia ) 植物 CHS 外显 子 2 序 列 的 分 析 , 认 为
CHS 基因家族在进化过程中已分化为 3 个亚家族 。

的研究相对不足 , 在花色基因工程改良中有关 CHI 转基因的报道也很少 (Nishihara et al . ,2005) 。
21113 　 查耳酮 2′ 葡糖基转移酶 　 如图 1 所示 ,查耳 酮 2′ 葡糖基转移酶 ( THC 2′ 2glucosyltransferase , THC2′ GT) 催化 THC 合成花瓣液泡中能稳定存在的黄色花 色素 ISP 。 等 ( 2002) 发现 THC2′ 在黄色香石竹 Itoh GT 21114 　 查耳酮还原酶 　 在一些开黄色花的菊科植 物中 ,查耳酮还原酶 ( chalcone reductase ,CHR) 与 CHS

研究表明 ,除欧芹 、 金鱼草和拟南芥 ( Arabidopsis thaliana ) 基因组中的 CHS 为单拷贝外 , 迄今鉴定过 的所 有 植 物 的 CHS 都 以 多 基 因 家 族 形 式 存 在 (Martin ,1993) 。不同 CHS 成员的组织发育和环境 诱导 的 特 异 性 表 达 在 豌 豆 ( Pisum sativum ) ( Ito et al . ,1997) 、 牵牛 ( Pharbifis nil ) ( Durbin et al . ,2000) 、 葡萄 ( Vitis vinifera ) ( G 2Yamamoto et al . ,2002 ) 、 oto 蝴 蝶兰 ( Phalaenopsis hybrida ) ( Han et al . ,2006) 等植物 中得到验证 。在此基础上 ,通过操作 CHS 进行花色 基因工程改良的探索也迅速展开 , 并因其处于花色 素苷合成途径的起始位置 , 抑制其表达已成为目前 浅色花色育种中广泛采用的手段 。van der Krol 等 (1988) 首次将反义 CHS 导入紫色矮牵牛 ( Petunia
hybrida) 中 ,明显抑制了花色苷的形成 , 得到开白花

大肠杆菌表达系统从中筛选出 2 条编码蛋白具有合 成查耳酮 2′ 糖苷活性的 cDNA 克隆 , 分别命名为 DicGT4 和 DicGT5 。目前 , THC2′ 的 cDNA 克隆已 GT 从香石竹中得到分离 , 并通过过表达该基因促使了 矮牵 牛 花 瓣 中 ISP 的 积 累 ( Ishida et al . , 2003 ; Okuhara et al . ,2004) 。

的植株 ; Fukusaki 等 ( 2004 ) 利用 RNAi 技术 , 使蓝色 夏堇 ( Torenia hybrida ) 中的 CHS 基因沉默后 ,获得了

开白色和灰白色花的转基因植株 ; 此外 , 成功的例 子在非洲菊 ( Gerbera hybrida ) 、 菊花 、 月季 、 香石竹 、 洋 桔 梗 ( Eustoma grandiflorum ) 和 龙 胆 ( Gentiana triflora ) 中也相继报道 ( Tanaka et al . ,1998 ; 2005) 。
21112 　 查耳酮异构酶 　 在植物体细胞质内 ,查耳酮 异构酶 ( chalcone isomerase , CHI) 催化查耳酮分子的

共同作用 , 将 THC 转化为稳定的 6′ 脱氧查耳酮 。 由于 6′ 脱氧查耳酮是大豆异黄酮的合成前体 , 因 此 CHR 基 因 最 早 从 大 豆 中 获 得 ( Welle et al . , 1991) 。目前 ,紫花苜蓿 ( Medicago sativa ) (Ballance et al . ,1995 ) 、 甘 草 ( Glycyrrhiza echinata ) ( Akashi et 刺 al . ,1996) 、 长喙田菁 ( Sesbania rostrata ) ( G oormachtig et al . ,1999) 等植物中的 CHR 也得到分离 。序列分 析发 现 , CHR 属 于 醛 酮 还 原 酶 超 家 族 ( aldo2keto reductase superfamily ,AKR) , 在植物体内以多拷贝存 在 。 过 表 达 葛 藤 ( Pueraria montana var. lobata ) 在 色由 红 色 变 为 白 色 或 粉 色 ( Joung et al . , 2003 ) ; Shimada 等 ( 2006 ) 将百脉根 ( Lotus japonicus ) CHR 导

环化 ,将黄色的 THC 转化成无色的柚皮素 ( 图 1 ) 。 由于 THC 是合成黄色花花色素的重要底物 ,而柚皮 素是其他类黄酮物质合成的直接前体 , 可以进一步 形成黄酮醇或花色素苷等红色 、 蓝色花卉的主要色 素来源 ,因此 CHI 在黄色花花色素生物合成中起关 键作用 。 CHI 最早从菜豆 ( Phaseolus vulgaris ) 中以抗体技 术分离 ( Mehdy et al . ,1987) 。香石竹 、 大豆 ( Glycine

入红色矮牵牛中 ,同样抑制了花青素的合成 ,并使花 色变淡 。 212 　 噢　生物合成相关酶及基因 噢　是类黄酮合成途径中由查耳酮支化产生的

花瓣呈色过程中起重要作用 。Y oshida 等 ( 2004 ) 推 测 THC2′ 基因表达量或酶活性的不同是造成不 GT 同品种黄色香石竹花瓣中 ISP 含量差异的主要原 因 。随后 ,Ogata 等 ( 2004) 利用 RT2PCR 技术从香石 竹花瓣中分离到 18 条 GT 基因的同源序列 , 并通过
CHR 的转基因烟草中 , 花青素含量减少了 40 % , 花

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图1　 类黄酮类色素的生物合成途径
Fig. 1 　 The biosynthetic pathway of flavonoids CHS : 查耳酮合酶 Chalcone synthase ; CHI : 查耳酮异构酶 Chalcone isomerase ; THC2′ 查耳酮 2′ GT: 葡糖基转移酶 THC 2′ 2glucosyltransferase ; CHR : FNS : 黄酮合成酶 Flavone synthase ; AS : 金鱼草素合酶 Aureusidin synthase.

一类最终产物 , 以金鱼草素 ( aureusidin) 及其糖苷为

代表 ,是形成金鱼草和波斯菊等明黄色花的主要色 素来源 ( 安田 齐 ,1989 ; Nakayama ,2002) 。目前 , 有 关噢　的研究都是以金鱼草为材料展开的 。然而 , 尽管早在 20 世纪 50 年代初人们就已发现了噢　的 鉴定直到近几年才有所突破 。

存在 ,但其生物合成途径中相关酶和基因的分离和 研究发现 , 噢　由 THC 或 2′ ′ ′ ,4 - 五羟 ,4 ,6 ,3 基查耳酮 ( 2′ ′ ′ ,42pentahydroxychalcone ,PHC) 氧 ,4 ,6 ,3 化产生 (Nakayama ,2002) 。在噢　生物合成途径中 ,
THC 或 PHC 首先在查耳酮 4′ O - 葡糖基转移酶 (chalcone 4′O2glucosyltransferase ,C4′ ) 的作用下在 2 GT

细胞质内合成 THC 4′ O - 糖苷或 PHC 4′ O - 糖 -

苷 ,转移至液泡后 , 以此为底物再在金鱼草素合酶 ( aureusidin synthase ,AS) 的催化下合成噢　 ( 金鱼草 素 6 - O - 糖苷) ( 图 1 ,Ono et al . ,2006a) 。Nakayama 等 ( 2000) 首次从金鱼草花瓣中获得 AS 蛋白 ,并通过 消减杂交分离了 AmAS1 的 cDNA 克隆 ,Northern 杂交

表明该基因的表达与黄色花瓣的呈色密切相关 。后

来 AS 被证明为一种含铜糖蛋白 , 是催化噢　合成 的专一酶 ( Sato et al . ,2001 ) 。对 AS 的初级结构和 底物特异性进行分析后 , 认为 AS 属于在高等植物 中广泛存在的多酚氧化酶 ( polyphenol oxidase , PPO) 家族 (Nakayama et al . ,2000 ; 2001) 。但最新研究发

32hydroxylase ; F3′ : 黄烷酮 - 3′ 羟基化酶 Flavonoid 3′ H 2hydroxylase ; F3′ H : 黄烷酮 3′′ 羟基化酶 Flavonoid 3′′ 5′ 5 5 2hydroxylase ; DFR : 二氢黄酮

查耳酮还原酶 Chalcone reductase ; C4′ 查耳酮 4′ O - 葡糖基转移酶 Chalcone 4′O2glucosyltransferase ; F3H : 黄烷酮 - 3 - 羟基化酶 Flavanone GT: 2 醇 4 - 还原酶 Dihydroflavonol 42reductase ; ANS : 花色素合成酶 Anthocyanidin synthase ; 3 GT: 类黄酮 3 - O - 葡糖基转移酶 32G lucosyltransferases ;

现 ,与 PPO 家族定位于质体不同 ,AmAS1 通过高尔

基体由内质网膜转移定位在液泡内 , 进一步证明噢 合 成 于 液 泡 内 , 而 并 非 细 胞 质 内 ( Ono et al . , 2006b) 。
213 　 叶黄素生物合成相关酶及基因

在类胡萝卜素生物合成途径中 ( 图 2 ) , 合成前 体异 戊 烯 焦 磷 酸 ( isopentenyl pyrophosphate , IPP) 在 IPP 异构酶 ( isopentenyl pyrophosphate isomerase , IPPI) 的作用下异构化为二甲基丙烯焦磷酸 ( dimethylallyl
diphosphate ,DMAPP) ,然后在　牛儿基　牛儿基焦磷 酸合酶 ( geranylgeranyl pyrophosphate synthase , GGPS)

催化下 ,DMAPP 与 3 个 IPP 分子缩合生成含有 20 个 碳 的 　 牛 儿 基 　 牛 儿 基 焦 磷 酸 ( geranylgeranyl pyrophosphate , GGPP) 。两分子的 GGPP 经头对头缩 合 ,由八氢番茄红素合酶 ( phytoene synthase , PSY) 催 化形成具 40 个碳原子的八氢番茄红素 ( phytoene ) 。 随后 , 八 氢 番 茄 红 素 在 八 氢 番 茄 红 素 脱 氢 酶 (phytoene desaturase ,PDS) 、 - 胡萝卜素脱氢酶 ( ζ ζ carotene desaturase , ZDS ) 和 类 胡 萝 卜 素 异 构 酶
( carotenoid isomerase ,CRTISO) 3 个酶的共同催化下经

ε cyclase ,LCYE) 催化的番茄红素环化是植物体内类 2 胡萝卜素合成途径的一个重要分支点 , 环化产物主

4 步去饱和反应转变为番茄红素 ( lycopene) 。由β 环 化酶 ( lycopene β cyclase ,LCY ) 和ε 环化酶 ( lycopene 2 B

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β- 胡萝卜素在 BCH 作用下转变成β- 隐黄质 ,进而 生成 玉 米 黄 质 。玉 米 黄 质 在 玉 米 黄 质 环 氧 化 酶

1998 ; 郑阳霞等 ,2006) 。基因转录水平上的表达分

2003) ; 万寿菊花瓣中随着 LCYB 表达量的增加 , 花

要为含 1 个β- 环和 1 个ε- 环的α- 胡萝卜素及其 衍生物 ,以及含 2 个β- 环的β - 胡萝卜素及其衍生 物 ( Grotewold ,2006 ; Tanaka et al . ,2008b) 。 α- 胡萝卜素和β - 胡萝卜素是叶黄素类化合 α β 物的合成前体 。 - 胡萝卜素在β - 环羟化酶 ( 2 hydroxylase , BCH ) 和 ε - 环 羟 化 酶 (ε hydroxylase , 2 ECH) 的共同作用下生成叶黄素 ( Tian et al . ,2004) 。
IPPI : IPP 异构酶 Isopentenyl pyrophosphate isomerase ; GGPS :

(zeaxanthin epoxidase , ZEP ) 作 用 下 生 成 花 药 黄 质 (antheraxanthin) , 进而生成堇菜黄质 。在强光胁迫

图2　 植物类胡萝卜素的生物合成途径 ( Tanaka et al . ,2008b)
Fig. 2 　 Carotenoid biosynthesis pathway in plants( Tanaka et al . ,2008b)

牛儿基　牛儿基焦磷酸合酶 Geranylgeranyl pyrophosphate synthase ; PSY: 八氢番茄红

　　 在上述途径中 , 涉及叶黄素生物合成的酶和基 因已在多种植物中分离和鉴定 ( Cunningham et al . , 析表明 ,类胡萝卜素合成基因参与花色形成的转录 调控 。如黄花龙胆 ( Gentiana lutea ) 花发育过程中 ,
LCYB 和 LCYE 表达的相对强弱决定了由α - 胡萝卜

素生成的叶黄素和β- 胡萝卜素生成的玉米黄质和 新黄质在 类 胡 萝 卜 素 总 量 中 的 比 例 ( Zhu et al . , 色由白色到黄色 、 深黄色转变 (Del et al . ,2005) 。

早期植物类胡萝卜素遗传工程主要以增加粮食 作物的类胡萝卜素含量为目的展开 ( Sandmann et
narcissus ) PS Y 、 LCYB 基因和细菌八氢番茄红素脱氢

酶 crtI 基 因 一 起 构 成 表 达 载 体 转 入 到 一 个 水 稻 ( Oryza sativa ) 品种中 ,得到胚乳呈黄色的 “金大米” 。 后来 ,烟草 、 番茄 、 马铃薯 ( Solanum tuberosum ) 等植物 组织中类胡萝卜素含量的提高也相继实现 ( Ralley et
al . ,2004 ; Morris et al . ,2006) 。然而 ,类胡萝卜素基

因工程在花色分子育种中的应用还很少 。Ohmiya 等 ( 2006) 发现白色菊花中虽有类胡萝卜素的合成 , 但随后却在类胡萝卜素裂解双加氧酶 CmCCD4a 的

al . ,2006) 。Ye 等 ( 2000 ) 将黄水仙 ( Narcissus pseudo2

BCH β- 环羟化酶β Hydroxylase ; ECH ε- 环羟化酶ε Hydroxylase ; ZEP : 玉米黄质环氧化酶 Zeaxanthin epoxidase ; VDE : 堇菜黄质脱环氧化酶 : 2 : 2 Violaxanthin de2epoxidase ; NSY: 新黄质合酶 Neoxanthin synthase.

素合酶 Phytoene synthase ; PDS : 八氢番茄红素脱氢酶 Phytoene desaturase ; Z2ISO : 类胡萝卜素异构酶 Carotenoid isomerase ; ZDSζ- 胡萝卜素脱氢 : 酶ζ Carotene desaturase ; CRTISO : 类胡萝卜素异构酶 Carotenoid isomerase ; LCYE ε环化酶 Lycopeneεcyclase ; LCY β环化酶 Lycopeneβ cyclase ; 2 : 2 B: 2

下 ,堇菜黄质脱环氧化酶 ( violaxanthin de2epoxidase , VDE) 催化堇菜黄质转化为花药黄质 ,进而再转化为 玉米 黄 质 。堇 菜 黄 质 在 新 黄 质 合 酶 ( neoxanthin
synthase ,NSY) 催化下转化为高等植物类胡萝卜素生 物合 成 β,β 分 支 的 最 终 产 物 —— 黄 质 ( 图 2 , —新 Grotewold ,2006 ; Tanaka et al . ,2008b) 。

作用下裂解 ,从而使花瓣表现白色 ; 抑制 CmCCD4a

的表达可使花瓣由白色变为黄色 ; 反之 , 过表达 CmCCD4a 可使花瓣由黄色转变为白色 ( Tanaka et
al . ,2008a) 。Suzuki 等 ( 2007) 将细菌中编码β - 胡萝

卜素酮化酶的 crtW 基因在百脉根中过表达 ,使其花 瓣和 叶 片 中 积 累 了 虾 青 素 ( astaxanthin ) 、 黄 素 角 由浅黄色转变成深黄色或橙色 。

(canthaxanthin) 等新的类胡萝卜素化合物 , 花朵颜色

3　 黄色花基因工程的主要途径

通过上述分析可以发现 , 实现黄色花分子育种

主要有以下 2 条途径 : 对于不含类胡萝卜素的物种 , 破口 ,通过基因工程调控类黄酮的合成方向 ,抑制花

可以查耳酮和噢　生物合成途径中的关键基因为突 青素的合成和促进查耳酮或噢　的积累 ; 而花瓣内 抑制花青素的合成 ,使花瓣中只积累类胡萝卜素 ,也 能使花色变黄 。

同时含有类黄酮和类胡萝卜素 2 类物质的物种中 ,

311 　 抑制花青素的合成促进花瓣中查耳酮的积累

大量证据表明 ,CHI 活性的抑制是通过积累查

耳酮 类 化 合 物 使 花 朵 呈 现 黄 色 的 先 决 条 件 (Nishihara et al . ,2005 ) 。但目前 , 通过该方法进行

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花色改良的研究仅在烟草中有所报道 。Nishihara 等 (2005) 采用 RNAi 技术抑制了烟草中 CHI 的表达 , 使花瓣中花青素含量降低 ,查耳酮含量上升 ,花朵颜 色变浅 ,且花粉中也积累了大量查耳酮而表现黄色 。 值得注意的是 , 对于某些植物如矮牵牛 、 洋桔梗等 , 通过反义抑制或 RNAi 的方法均不能抑制 CHI 的活 性 ,或即使抑制了其活性但仍不能改变花色 ( van Blokland et al . ,1993) 。推测在这些植物体内查耳酮 可以在 CHI 失活的情况下产生自发异构 , 形成黄酮 醇 。为此 ,Davies 等 ( 1998 ) 尝试将紫花苜蓿查耳酮 还原酶基因 CHR 导入白色矮牵牛中 ,增强了查耳酮 的稳定性 ,并促进了它的积累 ,最终获得开淡黄色花 的转基因植株 。另外 , Zuker 等 ( 2002 ) 将反义 F3H 转入到只含天竺葵色素苷的橙色香石竹中后 , 转基 因株系中 F3H 的表达受到抑制 ,只积累了痕量的天 竺葵色素苷 ,并由于其自身具有合成 ISP 的活性 ,从 而使花色变成了黄色或乳黄色 。 312 　 导入新基因和基因抑制相结合促使噢　的合成 噢　生物合成相关基因的分离使得通过导入这 些外源基因来实现黄色花分子育种成为可能 。在类 黄酮代谢途径中 ( 图 1) ,噢　合成酶 C4′ 和 AS 与 GT 没有检测到噢　的合成 , 花朵颜色也未发生改变 ; 而将 AmAS 和 C4′ 共同表达时 ,花色变成了黄色 , GT 但仍能积累较多的花青素 ; 最后 ,通过 RNAi 技术抑 制花青素合成相关基因 F3H 或 DFR 的表达 , 再共
314 　 通过转录因子调控花色素的合成

植物的花青素合成过程中 。然而 , 尽管花色素苷转 录因子的调控作用模式在玉米 ( Zea mays ) 、 拟南芥 、 矮牵牛等植物中已获得较深入的研究 ( K oes et al . , 2005) ,但已知的转录因子主要参与花色素苷生物合 成后期阶段的调控 , 且转录调节在花色改良中的应 用主要集中在过表达这些调控因子以促进花色素苷 合成的研究中 ,如 Ray 等 ( 2003) 将玉米 MYC ( bHLH) 转录因子调节基因 Lc 转入紫花苜蓿中后 ,转化植株 中 CHS 、 F3H 基因的表达明显增强 , 花色素苷大量 积累 ,植株表现紫红色 。同时 ,也有证据表明该方法 具有正向与反向的双重作用 。Aharoni 等 ( 2001 ) 将 草莓 ( Fragaria grandiflora ) FaMYB 1 转入烟草中过量

CHI 、 等花青素合成酶存在底物竞争的关系 , 它 F3H

们分别催化查耳酮向噢　和花青素的方向代谢 。因 此 ,在导入外源新基因的同时 ,必须与抑制花青素合 成基因相结合才能最大限度地积累噢　 。Ono 等 (2006a) 在蓝花的夏堇中异源表达金鱼草 AmAS1 , 并

4　 存在的问题及展望

同表达 AmAS1 和 C4′ , 成功得到了后代的花朵中 GT 几乎不能积累花青素的开黄色花的转基因植株 。 313 　 抑制花青素基因的表达只积累类胡萝卜素 对于花瓣中既含有花青素又含有类胡萝卜素的 种或品种 ,通过抑制花青素生物合成相关基因的表

达 ,阻断其在花瓣中的积累 ,而类胡萝卜素的合成和 积累并不受影响 , 从而使花色变成黄色 。Suzuki 等 ( 2000) 抑制了深褐紫色夏堇花瓣中的 CHS 表达 , 花 青素的合成即被阻断 , 由于植株中同时含有类胡萝 卜素 ,因而转基因后代中出现了开淡黄色花的植株 。 除直接编码花色素生物合成酶的结构基因外 , 转录因子调节基因通过调节生物合成酶活性和色素 积累基因的时空表达等方式也在花色形成中起着重 要作用 。因此 ,在花色基因工程改良中 ,也可以利用

转录因子以增强或减弱原有代谢产物来改变花色 。 目前 , 研究较多的花色素苷基因转录调控因子 主要有 baisc2helix2loop2helix ( bHLH) 和 R2R32MY 两 B 大类相互作用的转录因子 ( Springob et al . , 2003 ) 。 此外 ,WD40 类蛋白的调控作用也广泛存在于多种 表达后 ,转化植株花瓣中花色素苷合成酶 ANS 、 GT 的活性降低 ,其基因表达受到抑制 ,花色素苷积累明 显减少 ,花冠由粉红色变为白色 。 研究发现 , 噢　生物合成调控机制独立于花色 素苷的合成调控 ( Schwinn et al . ,2006) , 但有关噢　 生物合成调控因子的了解很少 。Davies 等 ( 2006) 在 金鱼草中发现了 2 个调控噢　合成的基因座 , 即 Sulf urea 和 Violacea 。隐性的 sulf urea 等位基因能够 促进噢　的生成 , 因此该等位基因对噢　的生物合 成有负调控或竞争作用 ; 而 violacea 等位基因则对 噢　生物合成基因的空间表达起调控作用 。 步研究 : 如黄色花形成化学机制的进一步阐明 ; 黄 色花花色素生物合成途径中新基因的分离 ; 黄色花 呈色过程中相关内源基因表达规律的研究 ; 黄色花 花色素生物合成转录调节因子的分离 ; 类黄酮和类 胡萝卜素生物合成调控机制的进一步研究 ; 转录因 子蛋白质如何相互作用来协作调节花色素的生物合 成 ; CHI 基因正 、 反义抑制失败原因的阐明 ; 花器官 特异表达启动子的克隆和应用 ; 转类胡萝卜素合成 相关基因的黄色花基因工程的研究 ; 色素间相互关 系及共同着色的研究 ; 其他因子如花色素苷生物合

综上所述 , 植物类黄酮和类胡萝卜素生物合成 途径中有关黄色花形成的大多数酶和基因均已被分 离和鉴定 ,并且黄色花基因工程也取得了一定进展 。 但是 ,目前针对黄色花形成机制 ,尤其是黄色花分子 育种的研究还处于起步阶段 , 很多方面还有待进一

　 2期 第

周　 琳等 : 黄色花形成机制及基因工程研究进展

117

成的液泡扣押与沉积 、 液泡内 pH 值 、 金属元素的含 量和花瓣的结构等对黄色花呈色的影响等 。而且 , 尽管噢　合成基因的克隆为黄色花分子育种提供了 一条新的思路并具有广阔的应用前景 , 但表达载体 中花器官特异表达启动子的选择及外源基因导入后 如何克服基因沉默 , 保证其在植物体内能够稳定遗 传与表达也是黄色花基因工程研究中的重要问题 。 另外 ,目前有关甜菜色素生物合成的研究还非常有 限 ,其合成途径中的关键酶和基因仍未得到分离 ,转 录调控机制及基因工程的研究更未见报道 , 因此相 关研究也亟待开展 。 植物黄色花基因工程改良是一个系统工程 , 单 单调控一个基因的表达难以达到预期效果 , 需要综 合考虑相关因素 。目前 , 许多观赏植物的遗传转化 体系已经建立 ,随着黄色花形成机制和调控机理研 究的不断深入 ,以及转基因技术的不断完善 ,采用多 种技术手段相结合的方法 ,多方面探索 ,相信不久的 将来终能实现仙客来 、 天竺葵等观赏植物的黄色花 新品种创制 。 参
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( 责任编辑 　 　 ) 徐 红



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