FU和MG132选择性调控NKG2D配体表达及其机制初步研究
本文关键词：rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究，由笔耕文化传播整理发布。
《中国人民解放军军事医学科学院》 2010年
5-FU和MG132选择性调控NKG2D配体表达及其机制初步研究
罗丹
【摘要】： NK细胞是天然免疫的主要承担者,在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用【1-4】。与T细胞不同的是,NK细胞的细胞毒作用不受肿瘤细胞的MHC-Ⅰ类分子的限制,其细胞活性的发挥是其表达的各种受体分子与相应配体相互作用的结果。 NKG2D (NK group 2, member D)为NK细胞表面活化性受体,属C型凝集素超家族成员。NKG2D可以广泛地表达于多种免疫细胞【5,6】,如所有NK细胞表面以及部分NKT细胞、部分T细胞【7】。NKG2D的配体为MHC-I类相关分子(MHC class I-related molecules, MICs),包括MICA、MICB和ULBP1-5(病毒UL16结合蛋白)等【8】。MICA/B和ULBP1~3可被金属蛋白酶作用而从细胞表面脱落【9】。MICs为“诱导型”细胞表面抗原【10,11】,近年的研究【12】发现许多因素,如细胞应激、热休克、感染、DNA损伤和转化等均可上调它们的表达,病毒miRNA、基质金属蛋白酶等可影响NKG2D配体的表达【13-17】。 研究表明,由于肿瘤细胞的MHC-I类分子丢失或变异,使得特异性MHC限制性的细胞毒T细胞不能发挥作用。在这种情况下,识别非MHC-I类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的免疫反应中发挥关键的作用【18,19】。NKG2D通过与靶细胞表面诱导产生的相应配体结合,然后结合转接蛋白向NK细胞传递活化信号,使NK细胞获得攻击靶细胞的能力【20】。另外还为CD8 + T细胞提供必要的协同刺激信号,因此在很大程度上NKG2D途径的活化决定了机体的抗肿瘤细胞免疫水平。 文献报道DNA损伤反应可以通过诱导NKG2D配体的上调来增加肿瘤细胞对NK细胞的敏感性【21-24】,因此激活DNA损伤反应的药物/治疗方法(如放疗、化疗)和NK细胞治疗联合应用,有可能减少药物的副作用,提高肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性,提高抗肿瘤效果。 目前,化疗联合基于NK细胞的免疫治疗在临床上应用广泛,但化疗对NK细胞抗肿瘤活性的调节机制,尤其是对NKG2D介导的杀伤机制是如何调节的还不甚清楚。为什么同一个NKG2D受体在细胞上存在多种不同的配体?它们的作用有何差异?表达调控上有何不同?不同的化疗药物所造成的损伤不同,其调控NKG2D配体表达的通路差异是什么?虽然NKG2D配体编码区有一定保守性,但其5’非翻译区同源性很低,提示不同刺激或病变对不同的NKG2D配体的表达调控可能是特异的。 因此,本研究以肺腺癌A549细胞系为模型,研究不同作用机制的抗代谢抗肿瘤药5-FU和蛋白酶体抑制剂MG132对A549细胞的NKG2D配体表达及对NK细胞杀伤敏感性的影响,并探讨其可能的调控机制。 目的:研究5-FU和MG132对A549细胞NKG2D配体表达的调控及其机制。 方法:采用PCR方法,以A549细胞的全基因组为模板,扩增人NKG2D配体MICA/B的启动子及其5个截短体基因,并亚克隆入pGL3-Basic报告基因载体,转染A549细胞后运用双荧光报告基因系统进行启动子活性分析。用MTT法检测了不同浓度5-FU和MG132对A549细胞的抑制率;测定了300μM 5-FU、10μM MG132处理对MICA/B启动子活性的影响。采用荧光定量PCR和流式细胞术检测5-FU和MG132对NKG2D配体在mRNA、细胞表面蛋白水平上的表达变化;用彗星法观察5-FU和MG132处理A549后DNA的损伤情况;Western blot检测DNA损伤反应通路中信号分子Chk1、Chk2蛋白磷酸化;并观察了DNA损伤反应通路分子抑制剂对5-FU和MG132诱导NKG2D配体表达作用的影响。 结果:克隆了人MICA、MICB的启动子及其五个截短体基因并测定了启动子基础活性。5-FU可分别上调MICA/B启动子相对活性1.48和1.87倍, MG132可上调MICB启动子相对活性1.77倍。5-FU可提高MICB和ULBP2在mRNA水平的表达,分别是对照的1.76和3.28倍,而在细胞表面蛋白水平MICB蛋白表达水平没变化,ULBP2表达提高了16.05%;MG132可提高MICB、ULBP1、ULBP3在mRNA水平的表达,分别是对照的10.62、11.09和7.25倍,而细胞表面蛋白只有MICB、ULBP1表达分别提高了68.18%、23.65%。NK杀伤实验发现5-FU和MG132可提高NK细胞对A549细胞的杀伤率,NK对A549的杀伤作用可部分被NKG2D抗体、ULBP2抗体、MICB和ULBP1抗体抑制。5-FU和MG132处理可使A549细胞DNA发生损伤,彗星法(碱性裂解法)可观察到明显的拖尾现象,而且5-FU和MG132可分别使Chk1、Chk2发生磷酸化。使用ATM激酶抑制剂KU55933、Chk1抑制剂SB218078和PI3激酶抑制剂Wortmannin均可抑制5-FU和MG132引起的细胞表面ULBP2和MICB的表达上调。 结论:以上结果表明5-FU和MG132分别选择性上调了A549细胞表面ULBP2和MICB的表达,并增强了A549细胞对NKG2D及其相应配体介导的NK杀伤敏感性。5-FU对ULBP2表达的调节可能与DNA损伤反应通路中Chk1的磷酸化水平上升有关,MG132对MICB表达的调节可能与Chk2的磷酸化水平增加有关。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R730.3
【目录】：
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本文编号：118836
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